The receptor activity-modifying proteins (RAMPs) are ubiquitously expressed membrane proteins that interact with several G protein-coupled receptors (GPCRs), the largest and pharmacologically most important family of cell surface receptors. RAMPs can regulate GPCR function in terms of ligand-binding, G-protein coupling, downstream signaling, trafficking, and recycling. The integrity of their interactions translates to many physiological functions or pathological conditions.
Regardless of numerous reports on its essential importance for cell biology and pivotal role in (patho-)physiology, the molecular mechanism of how RAMPs modulate GPCR activation remained largely elusive.
This work presents new insights that add to the common understanding of the allosteric regulation of receptor activation and will help interpret how accessory proteins - RAMPs - modulate activation dynamics and how this affects the fundamental aspects of cellular signaling. Using a prototypical class B GPCR, the parathyroid hormone 1 receptor (PTH1R) in the form of advanced genetically encoded optical biosensors, I examined RAMP's impact on the PTH1R activation and signaling in intact cells. A panel of single-cell FRET and confocal microscopy experiments as well canonical and non-canonical functional assays were performed to get a holistic picture of the signaling initiation and transduction of that clinically and therapeutically relevant GPCR. Finally, structural modeling was performed to add molecular mechanistic details to that novel art of modulation.
I describe here that RAMP2 acts as a specific allosteric modulator of PTH1R, shifting PTH1R to a unique pre-activated state that permits faster activation in a ligand-specific manner. Moreover, RAMP2 modulates PTH1R downstream signaling in an agonist-dependent manner, most notably increasing the PTH-mediated Gi3 signaling sensitivity and kinetics of cAMP accumulation. Additionally, RAMP2 increases PTH- and PTHrP-triggered β-arrestin2 recruitment to PTH1R and modulates cytosolic ERK1/2 phosphorylation. Structural homology modeling shows that structural motifs governing GPCR-RAMP interaction originate in allosteric hotspots and rationalize functional modulation. Moreover, to interpret the broader role of RAMP's modulation in GPCRs pharmacology, different fluorescent tools to investigate RAMP's spatial organization were developed, and novel conformational biosensors for class B GPCRs were engineered. Lastly, a high throughput assay is proposed and prototyped to expand the repertoire of RAMPs or other membrane protein interactors.
These data uncover the critical role of RAMPs in GPCR activation and signaling and set up a novel platform for studying GPCR modulation. Furthermore, these insights may provide a new venue for precise modulation of GPCR
function and advanced drug design. / G Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte und pharmakologisch wichtigste Familie von
Zelloberflächenrezeptoren, die zahlreiche (patho-)physiologische Prozesse im menschlichen Körper steuern. GPCRs
übertragen während des Rezeptoraktivierungsprozesses extrazelluläre Signale in das Zellinnere, wo durch die
extrazelluläre Stimulation Konformationsänderungen des Rezeptorkerns auslöst und die Bindung intrazellulärer
Bindungspartner – G Proteine, G Protein-gekoppelte Rezeptorkinase und Arrestine - ermöglicht. Es handelt sich
also um einen kritischen Prozess in der Signaltransduktion, der durch einige endogene Moleküle wie Ionen, Lipide
oder andere Proteine moduliert werden kann und Auswirkungen auf nachgeschaltete Signalkaskaden hat.
GPCRs bilden gewebeabhängige Oligomere mit ihren interagierenden Partnern, Rezeptor-Aktivitäts-modifizierende
Proteinen (RAMPs), ubiquitär exprimierten Membranproteinen. Bekannt ist, dass sie die Ligandenbindung, die G-
Protein-Kopplung, die nachgeschaltete Signalisierung, das Trafficking und das Recycling einiger GPCRs modulieren.
Ihre Rolle im kritischsten Prozess der Signaltransduktion - der Rezeptoraktivierung - wurde jedoch nur begrenzt
erforscht.
Anhand des physiologisch und therapeutisch wichtigen Parathormon-Rezeptors (PTH1R), einem GPCR der Klasse B,
wurden die Modulationseffekte von RAMPs auf den Prozess der Rezeptoraktivierung und ihre Folgen für die
nachgeschaltete Signalübertragung analysiert. Hierzu wurden verschiedene optische Biosensoren zur Messung der
Aktivierung des PTH1R und seiner Signalkaskade entwickelt und in verschiedenen Versuchsanordnungen
eingesetzt, mit dem Ziel einen holistischen Blick auf die Interaktion zwischen PTH1R und RAMPs und ihre
funktionellen Auswirkungen zu erhalten.
Die Interaktion zwischen PTH1R und RAMPs erwies sich als besonders ausgeprägt für RAMP2, und RAMP2 zeigte
eine spezifische allosterische Modulation der PTH1R-Konformation, sowohl im basalen als auch im Liganden-
aktivierten Zustand. Ein einzigartiger voraktivierter oder (meta-stabiler) Zustand ermöglichte eine schnellere
Rezeptoraktivierung auf Liganden-spezifische Weise. Außerdem beeinflusste RAMP2 die G Protein- und Nicht-G
Protein-vermittelte Signalübertragung indem es die PTH-vermittelte Gi3-Signalempfindlichkeit und die Kinetik der
cAMP-Akkumulation modulierte. Weiterhin erhöhte RAMP2 die Menge der β-Arrestin2-Rekrutierung an PTH1R auf
Liganden-spezifische Weise. Dies könnte mit einer erhöhten zytosolischen ERK-Menge zusammenhängen, die hat
sich von der nukleären ERK-Phosphorylierung unterscheidet. Um einen molekularen Mechanismus für die
vorgestellten Ergebnisse vorzuschlagen, wurden mehrere strukturelle Modelle entwickelt und analysiert.
Diese Arbeit liefert den Beweis, dass RAMP die GPCR-Aktivierung mit funktionellen Auswirkungen auf die zelluläre
Signalübertragung reguliert. Die Ergebnisse sollten im Zusammenhang mit zellspezifischen Koexpressionsmustern
interpretiert werden und können zur Entwicklung von fortschrittlichen Therapeutika positiv beitragen. Da GPCRs
praktisch alle Zellfunktionen koordinieren und seit jeher wichtigen Angriffspunkten für Medikamente sind, tragen
die vorgestellten Erkenntnisse zum universellen Verständnis der molekularen Mechanismen bei, die den
menschlichen Körper orchestrieren.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:28858 |
| Date | January 2023 |
| Creators | Nemec, Katarina |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by-nd/4.0/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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