Orientador: Fátima Pereira de Souza / Banca: Alessandra Vidotto / Banca: Rogério de Moraes / Banca: Natália Bueno Leite Slade / Banca: Marcio José Tiera / Resumo: O Vírus Sincicial Respiratório Humano (hRSV) é o principal agente causador de doenças respiratórias agudas severas, como pneumonia e bronquiolite. Trata-se de um vírus da família Paramyxoviridae, com simetria helicoidal e envelope lipídico. Possui um genoma de RNA fita simples, não segmentado, com 10 genes codificantes. Um dos fatores que contribuem para o sucesso na replicação viral é a interação da proteína M2-1 com as proteínas P, M e com o RNA. Tal proteína age através da interação com RNA, e assim, participa efetivamente no processo de replicação viral, apresentando atividade anti-parada da replicação sendo ativa quando na forma tetramérica. Deste modo, o ligante que realizar interação com a M2-1 é um potencial candidato a prevenir as interações M2-1 com RNA e demais proteínas, impedindo deste modo o sucesso da replicação viral. Flovonoides são compostos naturais com várias atividades como antioxidante, anticancerígena, cardio protetora, antibacteriana e antiviral. Quercetina é um flavonoide que apresenta atividade antiviral, inibindo o complexo de replicação. Com a finalidade de investigar a interação de um potencial candidato a inibição da atividade da M2-1, clonamos, expressamos e purificamos a proteína M2-1 do hRSV e, determinamos sua característica físico-química de interação com quercetina em diferentes condições de temperatura. Para clonagem e expressão do gene M2-1 foram escolhidos o vetor pGEX-4T-1 e a bactéria Escherichia coli da linhagem BL21 Gold (DE3). A proteína expressa foi purificada em cromatografia de afinidade e cromatografia de exclusão molecular. As análises de composição de estrutura secundária e estabilidade térmica foram realizadas por espectroscopia de dicroísmo circular e, a interação com Quercetina com espectroscopia de fluorescência. Para o mapeamento da interação com a Quercetina foram realizadas docking molecular e dinâmica molecular. A proteína... / Abstract: Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is the major causative agent of acute respiratory infections such as pneumonia and bronchiolitis. This is a virus of the Paramyxoviridae family with helical symmetry and lipid envelope. It has a single strand RNA genome, not segmented, with 10 coding genes. One of the factors that contribute to success in viral replication is the interaction of M2-1 protein with P, M protein and RNA viral. Such protein acts through the interaction with RNA, hence, participating in the viral replication process, having anti-stop activity in the replication process and, the protein is active only as a tetramer. Thus, a ligand that interacts with M2-1 is a potential candidate to prevent interaction of M2-1 with other proteins, thereby preventing the success of viral replication. The aim of the research is to clone, express and purify the M2-1 protein of hRSV and then determine its physicochemical characteristics of the interaction with Quercetin in different temperatures to investigate the interaction of a potential candidate to inhibit the activity of the M2-1. The M2-1 gene was cloned in vector pGEX-4T-1 and expressed in Escherichia coli strain BL21 Gold (DE3). The expressed protein was purified on affinity chromatography molecular exclusion chromatography, thermal stability and secondary structure were analyzed by circular dicroism and the interaction with Quercetin was analyzed by fluorescence spectroscopy. To understand the interaction mechanism was performed molecular dynamics and molecular docking. The purified protein has 40% α-helix, 10% β-sheet, 19% turns and 31% random coils, being the melting temperature of 55,6°C. The titration of M2- 1 with Quercetin showed that it interacts in two points, on site 1 (the binding affinity is ~1,5x106 M -1 ) and stablishes an ionic interaction and, on site 2 (1,1x105 M -1 ) stablishes a hydrophobic interaction. One Quercetin molecule interacts on site 1 (formed by the ... / Doutor
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UNESP/oai:www.athena.biblioteca.unesp.br:UEP01-000868466 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Teixeira, Thiago Salem Pançonato. |
| Contributors | Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. |
| Publisher | São José do Rio Preto, |
| Source Sets | Universidade Estadual Paulista |
| Language | Portuguese, Portuguese, Texto em português; resumos em português e inglês |
| Detected Language | English |
| Type | text |
| Format | 98 f. : |
| Relation | Sistema requerido: Adobe Acrobat Reader |
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