Introdução: O sistema de grupo sanguíneo Rh é altamente complexo e polimórfico sendo considerado, depois do sistema ABO, o sistema de maior significado clínico na medicina transfusional. Os anticorpos dirigidos contra os seus antígenos estão envolvidos em reações hemolíticas transfusionais, anemia hemolítica autoimune e doença hemolítica do feto e neonatos. O antígeno D é o mais imunogênico dos antígenos do sistema Rh e sua conformação na superfície das hemácias está disposta como um mosaico de diferentes epítopos. Alterações no gene RHD, que expressa a proteína RhD, podem ser detectadas pela variação na intensidade da reação sorológica, utilizando-se diferentes reagentes anti-D. As alterações ocorrem por diversos mecanismos genéticos e são responsáveis pelo aparecimento dos fenótipos D fraco e D parcial. Essas variantes podem apresentar mudanças qualitativas e/ou quantitativas na proteína RhD e estão frequentemente envolvidas em casos de aloimunização anti-D. A identificação e classificação dos fenótipos RhD variantes possuem alta relevância clínicae, portanto, requerem uma rigorosa investigação molecular, uma vez que os testes sorológicos não são capazes de distinguir entre fenótipos D fraco e D parcial. Dessa forma, esclarecer os resultados fracos ou discrepantes encontrados na sorologia e determinar as variantes RhD têm grande importância para a comunidade científica e, principalmente, para a medicina transfusional. Objetivos: Caracterizar, por métodos moleculares, antígenos RhD variantes em amostras de doadores de sangue da Fundação Hemocentro de Brasília que apresentaram fraca expressão do antígeno RhD. Métodos: Foram selecionadas para extração de DNA e investigação molecular de antígenos RhD variantes 103 de 7983 amostras de doadores de sangue que apresentaram tanto resultados negativo, inconclusivo ou fraco (menor que 2 cruzes) na fenotipagem RhD, realizada por técnica em microplacas, como resultado positivo na confirmação de D fraco. Inicialmente, as amostras foram confirmadas quanto à presença do gene RHD por PCR multiplex RHD regiões íntron4/éxon7. Na sequência, técnicas de PCR alelo específico e RFLP foram utilizadas para triar as variantes D fraco tipos 1, 2, 3 e 4 ou DAR, seguido do sequenciamento de éxons específicos do gene RHD para investigação das demais variantes. As amostras foram avaliadas quanto à zigosidade por dosagem do gene RHD, por qPCR, e quanto à presença do Pseudogene (RHD?) e da deleção do gene RHD, por PCR-SSP. Os resultados encontrados foram interpretados em conjunto com os fenótipos RhCE também analisados. Resultados: Das amostras estudadas, 68,93% foram caracterizadas como RhD parcial; 21,36% como RhD fraco; 1,94% não apresentaram polimorfismos nos éxons do gene RHD e 2,91% apresentaram ausência de éxons RHD indicando a presença de um gene híbrido RHD-CE-D não definido. Entre as amostras RhD fraco, 16,5% eram RHD*fraco tipo 3; 5,8% RHD*fraco tipo 2; 1,94% RHD*fraco tipo 1; 0,97% RHD*fraco tipo 38 e 0,97% RHD*fraco tipo 145. Entre as amostras RhD parcial, 33,01% eram RHD*DAR 3.1; 32,04% RHD*DAR 1.2; 1,94% RHD*DVII; 0,97% RHD* DOL 1; 0,97% RHD* DOL 2. Discussão e conclusão: Nossos resultados demonstraram que as reações atípicas nos testes sorológicos para o antígeno RhD são indicativas da presença de variantes RhD. Os alelos RHD*DAR subtipos foram os mais frequentemente encontrados nas amostras dos doadores de Brasília-Distrito Federal. Esses alelos estão associados à aloimunização anti-D. A caracterização de antígenos RhD variantes por meio da associação de testes sorológicos e métodos moleculares visa, principalmente, determinar os fenótipos/genótipos associados à aloimunização anti-D. Essa caracterização é muito importante para aumentar a segurança transfusional, diminuir a administração desnecessária de imunoprofilaxia anti-D em gestantes e pode, também, colaborar com a preservação dos estoques escassos de unidades de sangue RhD negativo. Além disso, o conhecimento sobre a frequência e distribuição das variantes Rh contribui para a compreensão da origem multirracial da região estudada e auxilia no desenvolvimento de futuros protocolos de genotipagem RHD que estabeleçam estratégias de buscas de unidades de sangue compatíveis para pacientes portadores de variantes RhD. / Introduction: The Rh blood group system is highly complex and polymorphic, and considered, after the ABO system, the system of greater clinical significance in transfusion medicine. Antibodies directed against its antigens are involved in hemolytic transfusion reactions, autoimmune hemolytic anemia and hemolytic disease of the fetus and newborn. Antigen D is the most immunogenic of the Rh system and its conformation on the surface of red blood cells is a mosaic of different epitopes. Changes in the RHD gene, which expresses the RhD protein, can be detected by variations in the intensity of the serological reaction by using different anti-D reagents. The changes occur as a result of several genetic mechanisms and are responsible for the appearance of weak D and partial D phenotypes. These variants may exhibit qualitative and/or quantitative changes in RhD protein and are often involved in anti-D alloimmunization. The identification and classification of variant RhD phenotypes are of high clinical relevance. Therefore, they require a rigorous molecular investigation, since serological tests are not able to distinguish between weak D and partial D phenotypes. Thus, clarifying the weak or discrepant results found in serology and determining RhD variants are of great importance to the scientific community and especially to transfusion medicine. Objectives: To characterize, by molecular methods, variant RhD antigens in donor blood samples from the Blood Center Foundation of Brasília which showed poor expression of the RhD antigen. Methods: A total of 103 out of 7983 samples from blood donors who had negative, inconclusive or weak results (less than 2 crosses) in the microplate technique and also tested positive in the weak D confirmation test were selected for DNA extraction and molecular investigation of the RhD antigen. Initially, the presence of the RHD gene was confirmed in the samples by PCR multiplex RHD intron4/exon7 regions. Then, allele specific PCR and RFLP techniques were used to screen for weak D variant types 1, 2, 3 and 4 or DAR, followed by sequencing of specific exons of the RHD gene to investigate the other variants. Samples were evaluated for zygosity by RHD gene dosage by qPCR and for the presence of Pseudogene (RHD?) and RHD gene deletion by PCR-SSP. The results were interpreted in conjunction with the RhCE phenotypes also analyzed. Results: Of all samples studied, 68.93% were characterized as partial RhD; 21.36% as weak RhD; 1.94% had no polymorphisms in the RHD gene exons and 2.91% had no RHD exons indicating the presence of an undefined RHD-CE-D hybrid gene. Among the weak RhD samples, 16.5% were weak RHD*type 3; 5.8% RHD * weak type 2; 1.94% RHD*weak type 1; 0.97% RHD*weak type 38 and 0.97% RHD* weak type 145. Among the partial RhD samples, 33.01% were RHD*DAR 3.1; 32.04% RHD*DAR 1.2; 1.94% RHD*DVII; 0.97% RHD*DOL 1; 0.97% RHD*DOL 2. Discussion and conclusion: Our results demonstrated that atypical reactions in serological tests for the RhD antigen are indicative of the presence of RhD variants. The RHD*DAR subtype alleles were the most frequently found in donor samples from Brasília - Distrito Federal. These alleles are associated with anti-D alloimmunization. The characterization of variant RhD antigens through the association of serological tests and molecular methods mainly aims to determine the phenotypes/genotypes associated with anti-D alloimmunization. This characterization is very important to increase transfusion safety, reduce unnecessary administration of anti-D immunoprophylaxis in pregnant women and may also contribute to the preservation of scarce RhD negative blood units. In addition, knowledge about the frequency and distribution of Rh variants contributes to the understanding of the multiracial origin of the studied region, and assists in the development of future RHD genotyping protocols that establish compatible blood unit search strategies for RhD variant patients.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-05082019-112346 |
| Date | 04 June 2019 |
| Creators | Mafra, Ana Luisa Alves |
| Contributors | Sandoval, Evandra Strazza Rodrigues |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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