Eine intakte Darmbarriere ist überlebensnotwendig. Bei einigen Erkrankungen kann eine Störung der Darmbarriere zur Translokation von Bakterien aus dem Lumen des Darmes in den menschlichen Körper führen, die septische Entzündungsprozesse auslösen können. In dieser Arbeit untersuchten wir zum einen die Bedeutung der desmosomalen Adhäsion für die Darmbarriere und zum anderen die Rolle der Rho-GTPasen in der Regulation der Darmbarriere. Für unsere Untersuchungen charakterisierten wir Caco2 Zellen, von denen wir nachweisen konnten, dass sie ein geeignetes Modell für die Darmbarriere sind. Wir konnten zeigen, dass Caco2 Zellen 14 Tage nach ihrer Konfluenz einen vollständigen Schlussleistenkomplex ausbilden und funktionell ähnlich Permeabilitäseigenschaften, wie die Mukosa von Ratten ex vivo aufweisen. Um die Bedeutung der desmosomalen Adhäsion zu klären, applizierten wir einen gegen die Extrazellulärdomäne von Dsg2 gerichteten Antikörper. Dieser Antikörper war spezifisch in der Lage Dsg2 vermittelte Adhäsion zu blockieren. Nach Applikation des Dsg2 ED konnten wir eine Fragmentierung der Occludensproteine, sowie eine gestörte Barrierefunktion mit erhöhter Permeabilität und erniedrigtem transepithelialen Widerstand nachweisen. Damit konnten wir zeigen, dass die Dsg2 vermittelte Adhäsion essentiell für die Aufrechterhaltung der Darmbarriere ist. Des Weiteren untersuchten wir die Rolle der Rho-GTPasen. Wir veränderten die Aktivität der Rho-GTPasen durch Applikation von bakteriellen Toxinen, wie CNF-1, CNF-y, Toxin B, C3-TF und LT sowie Mediatoren, wie Y27632 und quantifizierten die Änderung anschließend durch die Aktivitätsmessung der Rho-GTPasen mittels GLISA. In Immunfluoreszenzen konnten wir zeigen, dass sowohl eine Steigerung als auch eine Erniedrigung der Aktivität von RhoA mit einer Fragmentierung der Occludensproteine einhergeht, während die Adherens Junktionen unbeeinflusst bleiben. Diese morphologische Veränderung korreliert mit einer signifikant erhöhten Permeabilität und einem erniedrigtem transepithelialem elektrischen Widerstand. Im Gegensatz dazu, konnten wir zeigen, dass eine Erhöhung der Aktivität von Rac1 und Cdc42 in der Immunfluoreszenz zu keinen sichtbaren Veränderungen führt, die funktionellen Ergebnisse, mit einem erhöhten transepithelialen elektischen Widerstand und einer erniedrigten Permeabilität auf eine Stabilisierung der Barriere hinweisen. Eine Erniedrigung der Aktivität von Rac1 und Cdc42 führt hingegen zu einer Destabilisierung der Barriere. Morphologisch führte die Verringerung der Aktivität von Rac1 durch LT zu einer Reduzierung der Occludensproteine an den Zellgrenzen und zu einer diffuseren Färbung des Adherens Junktionsprotein E- Cadherin. Zum anderen zeigte sich in diesem Fall eine deutliche Reduzierung der Barrierefunktion mit einem erniedrigten transepithelialen elektrischen Widerstand und einer erhöhten Permeabilität. Letzlich konnte diese Arbeit durch ihre Erkenntnisse einen Teil dazu beizutragen, dass die komplexe Regulation der Darmbarriere besser verstanden wird. Dieses bessere Verständnis soll künftig zur Entwicklung neuer Therapieoptionen für Patienten dienen, die unter den septischen Folgen einer Störung der Darmbarriere leiden. / The integrity of intestinal barrier function is essential. In some diseases intestinal barrier breakdown can lead to contamination by bacteria in the human body. In our research we investigated on the one hand the relevance of desmosomal adhesion and the role of Rho GTPases in regulation of intestinal barrier function. For our research we characterized Caco2 cells. We could reveal, that 14 days after confluence Caco2 cells form the "terminal bar" and show a barrier function similar to rat muccosa. To address the relevance ofdesmosomal adhesion we applied an antibody directed against the extracellular domain (Dsg2 ED) in order to test whether impaired Dsg2-mediated adhesion affects intestinal epithelial barrier functions in vitro. This antibody was capable to specifically block Dsg2 interaction. The application of Dsg2 ED led to a fragmentation in tight junction proteins and an impaired barrier function as revealed by an increase of permeability and a decrease of transepithelial electrical resistance. We could show that Dsg2 mediated adhesion is essential for intestinal barrier function. Second we investigated the role of the Rho-GTPases. We modulated the activity of Rho-GTPases by the application of bacterial toxins like CNF-1, CNF-y, toxin B, C3-TF and LT and mediators like Y27632. We could show that an increase as well as a decrease of RhoA activity led to a fragmentation of tight junction proteins as revealed by immunostaining. These morphologic changes correlated with a significant increase of permeability as well as a decreased transepithelial electrical resistance. Apart from that an increased activation of Rac1 and Cdc42 led to a stabilization of intestinal barrier function with an increase of transepithelial electrical resistance and a decrease in permeability. A destabilization of intestinal barrier function was shown after a reduction of Rac1 and Cdc42 activity. Under these conditions we could observe a fragmentation of tight junction and adherens junction proteins. Furthermore decreased Rac1 and Cdc42 activity led to an increased permeability and a decreased transepithelial electrical resistance. In the final analysis this publication led to new insights in the complex regulation of intestinal barrier functions and therefore can possible lead to new targets in the therapy of impaired intestinal barrier function.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:7225 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Meir, Michael |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/doku/lic_ohne_pod.php, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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