Die postovulatorische Alterung sowie die ovarielle Alterung konnten bei der Anwendung assistierter Reproduktionstechniken (ARTs) als entscheidende Faktoren identifiziert werden, die den Reproduktionserfolg nachhaltig beeinträchtigen. Die postovulatorische Alterung tritt ein, sobald die reife Eizelle nicht mehr innerhalb ihres physiologischen Zeitfensters befruchtet wird. Die ovarielle Alterung beschreibt hingegen die Abnahme des Follikel-Vorrats mit zunehmendem Alter des weiblichen Individuums bzw. des Ovars. Sowohl die postovulatorische Alterung als auch die ovarielle Alterung führen u.a. zu einer reduzierten Oozytenqualität und einer geringeren Blastozystenrate. Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand darin, den Einfluss der postovulatorischen Alterung und der ovariellen Alterung im Holstein-Rind (Bos taurus) auf die DNA-Methylierung entwicklungsrelevanter Gene in Eizellen und Embryonen zu untersuchen. Aus Schlachthof-Ovarien wurden Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (<2 mm, 3-5 mm und >6 mm) isoliert. Eizellen aus Follikeln der Größe 3-5 mm wurden für 24h (physiologisch) und 48h (gealtert) in vitro gereift (IVM). Die gereiften Oozyten wurden anschließend in vitro fertilisiert und Embryonen im 4-6 Zellstadium generiert. Sowohl in den unreifen Eizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe als auch in den gereiften Oozyten und den Embryonen wurde die Promotormethylierung der Gene bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4, bDNMT3Lo und bDNMT3Ls analysiert. Zur Untersuchung der ovariellen Alterung wurden mittelgroßen Antralfollikel aus Ovarien lebender Rinder (in vivo) unterschiedlichen Alters (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre) gewonnen. In den daraus isolierten unreifen Eizellen wurde die DNA-Methylierung der Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN bestimmt. Als Methode zur Analyse der Promotormethylierung wurde die Limiting Dilution Bisulfit-Sequenzierung angewendet.
In unreifen Eizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (<2 mm, 3-5 mm und >6 mm) konnte ein erhöhtes Auftreten abnormal methylierter Allele in den geprägten Genen bH19 und bSNRPN von Eizellen kleiner Follikel (<2 mm) identifiziert werden. Dieses Ergebnis könnte eine mögliche Ursache einer bereits bekannten und mehrfach beschriebenen geringeren Entwicklungskompetenz von Eizellen kleiner Follikel (<2 mm) auf epigenetischer Ebene darstellen.
Die verlängerte Reifungsdauer der IVM-Eizellen hatte eine signifikante Hypermethylierung in der Promotorregion des Gens DNMT3Lo von 48h-gereiften Eizellen zur Folge. Beim Übergang von 48h-gereiften Eizellen zum Embryo konnte eine signifikante Hypomethylierung von CpG7 des stammzellspezifischen Transkripts DNMT3Ls beobachtet werden. Diese CpG-Stelle wies ebenfalls einen signifikanten Anstieg von CpGs mit nicht-eindeutigem Methylierungszustand in unreifen Eizellen mit steigender Follikelgröße auf. Da sich die CpG-Position innerhalb eines Sequenz-Motivs einer Bindungsstelle des Transkriptionsfaktors CREB befindet, könnten die Methylierungsdaten auf eine Interaktion zwischen dem Transkriptionsfaktor CREB und der DNA-Methylierung während der Entwicklung und Reifung der Eizelle sowie der Transition von der Eizelle zum Embryo hindeuten.
Die DNA-Methylierungsprofile der untersuchten Gene in unreifen Eizellen aus Kühen unterschiedlichen Alters (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre) wiesen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Altersgruppen auf. Die ovarielle Alterung bei Rindern zwischen 9 Monaten und 11 Jahren zeigte damit keinen Effekt auf die DNA-Methylierung der untersuchten Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN.
Nach einer simulierten postovulatorischen Alterung durch eine in vitro Reifung für 48h konnte eine Veränderung der DNA-Methylierung der Oozyten-spezifischen (DNMT3Lo) und Stammzell-spezifischen (DNMT3Ls) Promotoren des katalytisch inaktiven Cofaktors von DNMT3A, DNMT3L, beobachtet werden. Die veränderte DNA-Methylierung von DNMT3Ls tritt dabei erst im frühen Embryo in Erscheinung und interagiert vermutlich mit dem Transkriptionsfaktor CREB. Die Veränderungen von DNMT3Lo in Eizellen und DNMT3Ls in den daraus generierten Embryonen lässt vermuten, dass es sich hierbei um eine dynamische Anpassung des Embryos auf äußere Umweltbedingungen der Eizelle über die Methylierung der DNA handelt. / Postovulatory aging and ovarian aging have been identified as key factors in assisted
reproductive techniques (ARTs) and have a lasting effect on reproductive success. Postovulatory
aging occurs if the mature egg is not fertilized within its physiological time window. On the other
hand, ovarian aging describes the decrease in the follicular reserve with increasing age of the
female or the ovary, respectively. Both post-ovulatory aging and ovarian aging result in reduced
oocyte quality and lower blastocyst rate. The aim of this thesis was to explore the effects of
postovulatory aging and ovarian aging in Holstein cattle (Bos taurus) on the DNA methylation of
developmentally important genes in oocytes and embryos. Antral follicles of different sizes (<2 mm,
3-5 mm and> 6 mm) were isolated from slaughterhouse ovaries. Female germ cells from middle-sized
follicles (3-5 mm) were matured for 24h (physiological conditions) and 48h (aged conditions) in
vitro (IVM). The IVM- oocytes were subsequently fertilized in vitro and embryos at the 4-6 cell
stage were generated. Promoter methylation of the genes bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4,
bDNMT3Lo and bDNMT3Ls was analysed in immature oocytes from antral follicles of different sizes as
well as in matured oocytes and the respective embryos. For studying ovarian aging, middle-sized
antral follicles were obtained in vivo from animals of different age groups (9-12 months, 3-7 years
and 8-11 years). In the extracted immature gametes, the DNA methylation of the promoter regions of
bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 and bSNRPN was examined. The limiting dilution
bisulfite (pyro)sequencing method was applied to determine the promoter methylation of the
candidate genes at the single allele level.
In immature oocytes from antral follicles of different diameters (<2 mm, 3-5 mm and> 6 mm) an
increased occurrence of abnormally methylated alleles of the imprinted genes bH19 and bSNRPN was
identified in small follicles (<2 mm). This failure to establish imprinting could be a possible
cause of a well-known reduced developmental potential of small follicles (<2 mm) at the epigenetic
level.
The extended maturation time of the IVM-oocytes resulted in a significant hypermethylation in the
promoter region of DNMT3Lo in 48h matured oocytes. After transition from 48h matured oocytes to
embryos, a significant hypomethylation of CpG7 of the stem cell specific transcript DNMT3Ls was
detected. The same CpG site showed a significant increase of CpGs with unclear methylation state in
immature female germ cells with increasing follicular size. This CpG position is located within a
potential binding site of the transcription factor CREB. Thus, the methylation data indicates an
interaction between the transcription factor CREB and the DNA methylation during development and
maturation of oocytes as well as during transition from the oocyte to the embryo.
The DNA methylation profiles of the analysed genes in immature oocytes from cows of different age
(9-12 months, 3-7 years and 8-11 years) showed no significant differences between age groups.
Hence, the ovarian aging in cattle between 9 months and 11 years caused no effect on the DNA
methylation of bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 and bSNRPN.
After a simulated postovulatory aging by in vitro maturation for 48h, a change in the DNA
methylation of the oocyte-specific (DNMT3Lo) and stem cell-specific (DNMT3Ls) promoters of the
catalytically inactive DNA-methyltransferase DNMT3L was observed. The altered DNA methylation of
DNMT3Ls occurs in the early embryo and probably interacts with the transcription factor CREB. The
changes of DNMT3Lo in oocytes and DNMT3Ls in the resulting
embryos might represent a dynamic adaptation to external environmental conditions.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:14456 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Mattern, Felix |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/doku/lic_mit_pod.php, info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0032 seconds