As sementes do cacaueiro (Theobroma cacao L.) constituem a única fonte de manteiga de cacau, matéria prima fundamental para as indústrias de chocolates e confeitos, farmacêutica e cosmética. Cerca de 50 % do peso seco das sementes é composto por gordura, caracterizada pelo alto nível de estearato (30-37%), em combinação com palmitato (24-31%) e de oleato (33-39%), conferindo-lhe uma composição triglicerídica única, responsável pelas suas propriedades de fusão, com aplicações específicas e especiais. Apesar dos genes que codificam as enzimas da via metabólica de biossíntese de ácidos graxos e triglicerídeos em plantas serem conhecidos, os mecanismos moleculares pelos quais as plantas controlam a produção de estearato e que diferenciam as plantas acumuladoras de estearato de todas as demais não estão claramente definidos. O objetivo deste trabalho foi analisar a composição de ácidos graxos nos frutos de Theobroma cacao e a expressão temporal de genes relacionados à via metabólica de ácidos graxos e triglicerídeos durante o desenvolvimento de sementes de T. cacao, com ênfase na acumulação de estearato. Em paralelo, foram eleitos os genes referências mais estáveis para os estudos em embriões e diversos tecidos de Theobroma cacao. Empregando-se a técnica de reação quantitativa da amplificação em cadeia de transcritos reversos de RNA (RT-qPCR), foram analisadas a expressão dos genes codificadores da proteína carregadora de acil A, B e C, \'beta\'-cetoacil-ACP sintase II, \'delta\'9estearoil-ACP desaturase A e B, Acil-ACP tioesterase A, acil-ACP tioesterase B, acil-CoA sintetase A e B e da proteína oleosina. Quando se estudou de expressão gênica apenas nos embriões de T. cacao, os três genes mais estáveis foram proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil A e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. Quando se considerou diversos tecidos de plantas de Theobroma cacao, os melhores genes para a normalização dos valores de expressão foram os codificadores da proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil B e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. A acumulação de transcritos da \'delta\'9estearoil-ACP desaturase foi relacionada ao aumento do ácido oleico. O aumento na quantidade deste ácido acontece pela ação conjunta da \'delta\'9estearoil-ACP desaturase, e acil-ACP tioesterase A, a qual mostra maiores níveis de transcritos entre 90 e 140 DAP com pico aos 100 DAP. O aumento de ácidos esteárico estaria relacionado com a ação conjunta e com transcrição temporalmente coordenada dos genes das enzimas \'beta\' -cetoacil-ACP sintase II, Acil-ACP tioesterase A e Acil-ACP tioesterase B. Transcritos da enzima \'beta\' -cetoacil-ACP sintase II apresenta pico aos 100 DAP, possivelmente com acúmulo máximo de substratos 18:0-ACP, que poderiam ser hidrolizado preferencialmente pela enzima acil-ACP tioesterase A, ou acil-ACP tioesterase B, O intervalo entre o pico de acúmulo de trasncritos entre \'beta\'-cetoacil-ACP sintase II (100 DAP) e Acil-ACP tioesterase A e \'delta\'9estearoil-ACP desaturase (110 DAP) sugere que poderia ocorrer um acúmulo de estearato resultante da ação dessas enzimas. Esses resultados corroboram o modelo de acumulação de estearato proposto por Silva (2005) / Cacao seeds (Theobroma cacao L.) are unique sources of cocoa butter, fundamental raw material for the chocolate, confectionary, cosmetic and pharmaceutical industries. Around 50% of the seed dry weight represents fat, characterized by the high levels of stearate (30-37%), in combination of palmitate (24-31%) and oleate (33-39%), giving a unique triacylglycerol compostion, responsible for the melting profile for special and specific applications. Despite the fact that genes encoding enzymes of the fatty acid and triglyceride biosynthetic pathway of plants are known, the mechanisms to control the accumulation of high levels of stearate, that differ from other species, are not clearly defined. The objective of this work was to analyse the composition of fatty acids and the expression of genes associated with fatty acid and triglyceride biosynthetic pathway during the development of cacao pods, with emphasis with stearate accumulation. In parallel, the establishment of stable reference genes to investigate gene expression in developing embryos and other cacao tissues were investigated. Using the quantitative amplification of reversed transcripts (RT-qPCR), the expresion of genes coding for the acyl-carrier protein A, B and C; \'beta\'-ketoacyl-ACP sinthase II; \'delta\'9stearoyl-ACP desaturase A and B; Acyl-ACP thioesterase A; Acyl-ACP thioesterase B; Acyl-CoA sintethase A and B; and oleosin. When gene expression was conductd only in developing cacao embryos, the three most stable genes were the ribosomal protein L35, acyl-carrier protein A and glyceraldehide 3-phosphate dehydrogenase. When various tissues were considered, the best reference genes for gene expression normalization were those encoding for the ribosomal protein L35, acyl carrier protein B and glyceraldehide 3-phosphate dehydrogenase. The accumulation of \'delta\'9stearoyl-ACP desaturase transcripts could be associated with the accumulation of oleate, together with the increase of acyl-ACP thioesterase A, with increased relative levels of transcripts between 90 and 140 DAP, peaking at 100 DAP. The increase in stearate might result from the joint activity of the \'delta\'9stearoyl-ACP desaturase and acyl-ACP thioesterase A, which presented higher accumulation of transcripts between 90 and 140 DAP, with peak at 110 DAP. The increase in stearate would associated with the joint and temporal coordinated expression of genes encoding \'beta\'-ketoacyl-ACP synthase II, and Acyl-ACP thioesterase A and B. Transcripts of the enzyme \'beta\'-ketoacyl-ACP synthase II peaked at 100 DAP, possibly with the maximum accumulation of substrates 18:0-ACP, that would be preferentially hydrolzyed by the enzyme acyl-ACP thioesterase A, or acyl-ACP thioesterase B, The gap between the peak in transcript accumulation between \'beta\'-ketoacyl-ACP synthase II (100 DAP) and acyl-ACP thioesterase A and \'delta\'9stearoyl-ACP desaturase (110 DAP) could lead to the accumulation of stearate. These results corroborated the model proposed by Silva (2005)
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-10122009-095811 |
| Date | 28 August 2009 |
| Creators | Pinheiro, Thaísa Tessutti |
| Contributors | Figueira, Antonio Vargas de Oliveira |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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