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Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A candidíase é uma infecção oportunista provocada por diversas espécies de fungos do
gênero Candida, frequentemente encontrados integrando a microbiota, da superfície cutânea,
no trato gastrointestinal e cavidades mucosas do ser humano desde o seu nascimento. A
incidência das infecções fúngicas sistêmicas têm aumentado consideravelmente nas últimas
décadas em função do grande número de pacientes com SIDA, a grande quantidade de
transplantes e condições crônicas como o câncer, a terapia prolongada com
imunossupressores e o uso de agentes corticosteroides. Além disso, a exposição prolongada
aos antifúngicos azólicos promove a seleção de patógenos resistentes. No presente estudo
avaliou-se a atividade antifúngica do complexo Rutênio-pirocatecol (RPC) frente a um
isolado clinico de Candida tropicalis resistente ao fluconazol. A metodologia empregada para
os testes de susceptibilidade foi de acordo com o documento M27-A3 do National Committee
for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2008). Esplenócitos de camundongos Balb/c
foram obtidos de forma asséptica para avaliar a citotoxicidade do composto para células de
mamíferos. O estresse oxidativo promovido pelo composto foi avaliado através da reação ao
ácido tiobarbitúrico (TBARS) e ensaios de fluorescência com a sonda
diclorodihidrofluoresceína diacetato (DCFH2DA). O Calcofluor White foi empregado para
avaliar a integridade da parede celular. A análise ultraestrutural foi realizada através da
microscopia eletrônica de varredura e transmissão. Os resultados encontrados para os testes de
atividade antifúngica foram analisados através do teste estatístico ANOVA e pós-teste
Dunnett. Os resultados encontrados para os testes de atividade antifúngica do RPC mostraram
uma Concentração Inibitória de 50% (IC50) de 20,3 μM, enquanto em esplesnócitos a
concentração efetiva de 50% foi de 325 μM mostrando um índice de seletividade igual a 16.
O referido composto também mostrou um elevado efeito pró-oxidante quando avaliamos os
níveis de estresse oxidativo através da TBARS e por meio da sonda DCFH2DA. Quando as
leveduras foram tratadas por 24 h com o referido composto, observamos na microscopia de
varredura o desenvolvimento de pseudo-hifas com 9 μM, a formação de fissuras em sua
parede e uma forte agregação das células com 18 μM, além disso, encontramos uma intensa
redução na quantidade de células e muito debris celular com 38 μM. Na microscopia de
transmissão observamos estruturas vesiculares no espaço periplasmático associado a grânulos
eletrondensos, os quais também foram vistos associados a parede celular, quando tratadas por
3h com 40 μM. No tratamento por 24h com 60 μM observamos a referida estrutura granular
eletrondensa no citoplasma envolta por membrana, uma grande quantidade destas estruturas
no espaço citoplasmático e associado a parede da célula, além disso, também observamos
trechos de membrana associado a estas estruturas no espaço extracelular. Em conclusão, a
atividade antifúngica e o índice de seletividade do RPC contra uma cepa resistente é
consideravelmente interessante devido as suas possibilidades de aplicações na descoberta de
novos antifúngicos / Candidiasis is an opportunistic infection caused by several species of fungi of the
genus Candida, often found is the microbiota, on the skin, gastrointestinal tract and mucous
cavities of the human beings birth. The incidence of systemic fungal infections have increased
considerably in recent decades due to the large number of AIDS patients, the large number of
transplants and chronic conditions such as cancer, prolonged therapy promotes the selection
of resistant pathogen with immunosuppressant and corticosteroid agents. Also prolonged
exposure azole antifungals to make them strong candidates for patients resistance. In the
present study we evaluated the antifungal activity of Ruthenium-pyrocatechol complex (RPC)
against a clinical isolate of Candida tropicalis resistant to fluconazole. The methodology for
susceptibility testing was in accordance with the M27-A3 document of there National
Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2008). Splenocytes from Balb/c mice
were obtained aseptically to evaluate the cytotoxicity of the compound to mammalian cells.
Oxidative stress caused by the compound was assessed by reaction to thiobarbituric acid
(TBARS) and fluorescence assays with the probe diclorodihidrofluoresceína diacetate
(DCFH2DA). The Calcofluor White was used to evaluate the integrity of the cell wall. The
ultrastructural analysis was performed by scanning and transmission electron microscopy. The
results for the antifungal activity tests were analyzed using ANOVA and pos-test Dunnett test
statistic. The results for the tests of antifungal activity of the RPC showed a 50% inhibitory
concentration (IC50) of 20.3 μM while in splenocytes the 50% effective concentration was 325
μM showing a selectivity index of 16. The compound also showed that a high pro-oxidant
effect when evaluated levels of oxidative stress by TBARS and through DCFH2DA staining.
When yeast cells were treated for 24 h with this probe, in scanning microscopy we observed
the development of pseudohyphae 9 μM, the formation of cracks on their fungal walls and in
these cell aggregation with 18 μM furthermore found a remarkable reduction in the number of
cells, and cell debris with 38 μM. In transmission microscopy vesicular structures observed in
the periplasmic space associated with electrondense granules, which were also seen associated
with the cell wall, when there cells were treated for 3 h with 40 μM. In the treatment for 24h
with 60 μM observed that the grain structure in the clusters in periplasmic, a large amount of
these structures in the cytoplasmic space and associated with the cell wall, moreover, we also
observe membrane portions associated with these structures in the extracellular space. In
conclusion, the antifungal activity and the selectivity index RPC against a resistant strain is
pretty interesting because of its possible applications in the discovery of new antifungal
agents.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/9954 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Gomes Júnior, Rafael Araújo |
| Contributors | Barros, Tania Fraga, Cruz, Frederico Geare, Bezerra, Daniel Pereira, Santos, Marcos André Vannier dos |
| Publisher | Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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