Esta tese é composta de estudos realizados com a finalidade de encontrar condições experimentais e gerar informações confiáveis que possam ser utilizadas em síntese de peptídeos mediada por lipases. Inicialmente, foram caracterizadas por eletroforese do tipo PAGE-SDS e medida de atividade em óleo de oliva duas lipases purificadas de Candida cylindracea (CCL) e duas pancreáticas suínas, purificada (pPPL) e bruta (cPPL). As CCLs apresentaram atividades lipásicas e graus de purezas superiores às PPLs. Dentre os contaminantes das PPLs, foram identificadas a tripsina e a α-quimotripsina (α-QT). Em seguida, foi realizado um estudo sistemático da síntese do dipeptídeo modelo Ac-Tyr-Gly-NH2. A melhor condição experimental encontrada foi: mistura de n-hexano/tampão Tris-HCl, 0,5M, pH 8,0, (80/20,v/v), 50mg/mL de cPPL, 0,05M de Ac-Tyr-OEt, 0,5M de Gly¬NH2, 37°C e agitação de 300 rpm, que forneceu rendimento de ~90 % em 5 min de reação. Porém, nesta condição foi observada a hidrólise secundária do produto formado, a qual foi extinta pelo tratamento da cPPL com um inibidor específico de α-QT. A condição otimizada de síntese de Ac-Tyr-Gly-NH2 também se mostrou adequada à preparação de Z¬Asp-Gly-NH2 a partir de Z-Asp-OMe e de Gly-NH2. Quando se estudou a influência da percentagem de n-hexano na eficiência da formação de ligação peptídica, ela também foi a melhor condição. Tendo escolhido a lipase e o meio reacional, iniciou-se um estudo sistemático da hidrólise do éster de onze Z-aminoácidos-OMe, o qual visou gerar informações que possibilitassem prever quais aminoácidos deveriam compor o doador de acila esterificado a ser empregado em síntese de peptídeos catalisada por cPPL. A ordem de preferência desta preparação enzimática na hidrólise de ésteres dos Z-aminoácidos-OMe testados foi a seguinte: (Lys, Arg e His)>(Phe e Tyr)>(Asp, Glu, Gln, Ser, Thr e Leu). Também foi estudada a influência da natureza do éster e do protetor de grupo α-amino na hidrólise de ésteres de Nα-acil-Asp ou -Glu. A cPPL preferiu hidrolisar o éster benzílico de Z ou Boc-Asp e de Z-Glu. Em algumas incubações para a hidrólise do éster de Z-aminoácidos-OMe foi observada uma reação secundária com possível aplicação na química de peptídeos: a remoção do grupo Z com formação do aminoácido livre correspondente. Esta ocorreu mesmo quando a tripsina e a α-QT foram inibidas irreversivelmente. Assim, Z-aminoácidos foram incubados com a cPPL e os resultados obtidos demonstraram que ela foi capaz de remover o grupo Z de onze deles com velocidades iniciais que obedecem a seguinte ordem: Tyr>Phe>Ser>Gln>Lys>His>Trp>Leu>Met>Arg>Ile. A remoção em questão também foi observada quando o dipeptídeo Z-Gly-Phe foi incubado em presença de cPPL. A formação de glicina no meio reacional decorreu da hidrólise da ligação peptídica. Sumarizando, as contribuições mais relevantes deste trabalho são: 1) a proposição inédita de um sistema bifásico para a formação da ligação peptídica catalisada por cPPL; 2) a demonstração inequívoca da presença de tripsina e α-QT e a sugestão de contaminação por carboxipeptidase A na cPPL. Estes contaminantes podem contribuir para a eficiência das sínteses de peptídeos catalisadas por esta preparação enzimática; 3) a constatação de que apesar de mais impura, a cPPL catalisou mais eficientemente do que as CCLs a formação de ligação peptídica via aminólise de ésteres; 4) a obtenção de resultados de um estudo sistemático de hidrólise de ésteres de Z-aminoácidos que podem auxiliar na escolha de doadores de acila a serem usados em sínteses de peptídeos catalisadas por cPPL; 5) a observação inédita de remoção do grupo Z de alguns Z-aminoácidos em presença de cPPL que indicou a possibilidade de novas aplicações desta preparação enzimática em química de peptídeos e, provavelmente, em síntese orgânica. / This work aimed to determine experimental conditions and reliable information to be used in peptide synthesis mediated by lipases. Thus, two Candida cylindracea lipases (CCL) and two porcine pancreatic lipases, a purified (pPPL) and a crude (cPPL), were characterized by PAGE-SDS electrophoresis and activity in olive oil. CCLs presented higher purities and enzymatic activities than PPLs. Trypsin (T) and α-chymotrypsin (α¬CT) were identified among the cPPL contaminants. A systematic investigation of Ac-Tyr¬Gly-NH2 was then performed using the CCLs, the PPLs and several experimental conditions. The best combination was: 0.05M Ac-Tyr-OEt, 0.5M Gly-NH2, 50mg/mL cPPL, mixture of n-hexane/Tris-HCl buffer 0.5M, pH 8.0, (80/20,v/v), temperature of 37176;C, shaking at 300 rpm (yield near 90% in 5 min of reaction). As secondary hydrolysis occurred in long-lasting reactions, cPPL was treated with the irreversible inhibitor of α-CT and had the amidase activity extinguished. The optimized synthesis conditions were also suitable for the preparation of Z-Asp-Gly-NH2. When the effect of the n-hexane content on coupling efficiency was examined, those were confirmed as the best conditions to be used. A further systematic investigation aiming to determine which esterified Nα-acyl-amino acids are good substrates for cPPL was then conducted using Z-amino acids-OMe. The results obtained in the monitoring of the ester hydrolysis indicated the following preference: (Z-Lys-OMe, -Arg-, -His-)>(Z-Phe-OMe, Tyr-)>(Z-Asp-OMe, -Glu-, -Gln-, ¬Ser-, -Thr-, Leu-). The natures of the ester and N-protecting group influenced the ester hydrolyses of Nα-acyl-Asp and Glu. The best substrates were Z or Boc-Asp-OBzl and Z-Glu-OBzl. Surprisingly, Z-group removal occurred in a few ester hydrolysis reactions since the resulting Z-amino acids were consumed and the corresponding free amino acids were formed. This unexpected reaction was not avoided when cPPL was treated with irreversible inhibitors of T or of α-QT. Incubation of cPPL with 11 of the 20 Z-amino acids tested gave Z-group removal initial rates that followed the order: Tyr>Phe>Ser>Gln>Lys>His>Trp>Leu>Met>Arg>Ile. In the presence of cPPL the Z-group was also removed from the dipeptide Z-Gly-Phe. Interestingly, free Gly was also detected in the reaction medium. In summary, the most relevant contributions of the present work are: 1) the proposal of a biphasic solvent system suitable for peptide bond formation catalyzed by cPPL; 2) the unequivocal demonstration that T and α-QT are contaminants of cPPL and the suggestion that carboxypeptidase A can also be present in it (all of them may interfere in the efficiency of peptide formation catalyzed by cPPL); 3) the verification that, although impure, cPPL catalyzed dipeptide synthesis more efficiently than the CCLs; 4) the performance of the first systematic study of ester hydrolysis of Z-amino acids catalyzed by cPPL; 5) the observation of Z group removal during some Z-amino acid ester hydrolyses catalyzed by cPPL and the confirmation that this is also feasible for some Z¬amino acids and a Z-dipeptide.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-14112014-105911 |
| Date | 11 March 2004 |
| Creators | Cleber Wanderlei Liria |
| Contributors | Maria Teresa Machini de Miranda, Joao Valdir Comasseto, Sandro Roberto Marana, Reinaldo Marchetto, Maria da Graça Nascimento |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Biológicas (Bioquímica), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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