A proteína colibistina (CB), uma Rho GEF neuro-especifica, apresenta papel importante na formação e funcionamento das sinapses inibitórias do sistema nervoso central por interagir com a proteína scaffold gefirina e com receptores GABAA e promover o agrupamento e transporte dessas proteínas para a membrana pós-sináptica. Recentemente, nosso grupo de pesquisa identificou interação de CB com um complexo proteico que controla o início da tradução em eucariotos (complexo eIF3), o que sugeriu pela primeira vez que essa proteína pode estar envolvida também na regulação da tradução em células neurais. Ainda, já havia sido descrito que gefirina, parceira funcional de CB, interage com mTOR, uma quinase que desempenha papel fundamental no controle do início da tradução. Contudo, até o momento não havia estudos adicionais investigando o papel de CB neste cenário. Assim sendo, o presente trabalho teve como objetivo investigar o envolvimento da proteína CB no controle do início da síntese proteica mediada pela via de sinalização mTORC1. Foram utilizados dois modelos experimentais: i) um sistema de expressão heteróloga - superexpressão de CB em células HEK293T, e ii) um modelo endógeno de expressão - células neuroprogenitoras derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iNPCs) provenientes de indivíduos controles e de um paciente com deleção no gene da CB. Por meio de experimentos de coimunoprecipação nós verificamos que CB interage fisicamente com mTOR nos dois modelos experimentais utilizados. Ainda, nossos resultados mostraram que CB parece modular a atividade da via mTORC1, e nas iNPCs derivadas do paciente a ausência de CB leva a um aumento na ativação desta via de sinalização. Em concordância com esses resultados, nós observamos aumento em neo-síntese proteica nas iNPCs provenientes do paciente, o que pode ser um mecanismo patofisiológico contribuindo para as alterações cognitivas e comportamentais observadas no paciente. Embora estudos adicionais sejam necessários para melhor entender os mecanismos moleculares deste controle de início de tradução mediado por CB, nós sugerimos um modelo no qual CB, por interagir fisicamente com mTOR e eIF3, sequestra estas proteínas e impede que mTOR ative seus alvos e desencadeie a formação do complexo de inicio de tradução. Em conclusão, nossos resultados oferecem novas evidências do envolvimento de CB no controle da síntese proteica / Collybistin (CB), a neural specific RhoGEF, plays key roles in inhibitory synapse formation and function that cluster and localize the scaffold protein gephyrin and GABAA receptors to the neural postsynaptic membrane. We have recently reported that CB interacts with a protein complex that controls translation initiation in eukaryotic cells (eIF3 complex), which suggested for the first time that this protein may also act as regulator of protein synthesis in neural cells. Moreover, it has been previously described that gephyrin, the CB functional partner, interacts with mTOR, a kinase that plays a pivotal role in the control of translation initiation. However, until now there were no further studies investigating the role of CB in this scenario. The purpose of this study was to investigate if CB is involved in the control of translational initiation mediated by the mTORC1 signaling pathway. Two experimental models were used: i) a heterologous expression system - overexpression of CB in HEK293T cells, and ii) an endogenous expression model - neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells (iNPCs) from control individuals and a patient with a deletion of the entire CB gene. We performed coimmunoprecipitation experiments and verified that CB physically interacts with mTOR both in 293T cells and in control iNPCs. In addition, our results show that CB appears to modulate the activity of mTORC1 pathway, and the absence of CB leads to increased mTORC1 signaling activation in patient\' iNPCs. In agreement with these results, we observed increased de novo cap-dependent translation in patient cells, which could be a pathophysiological mechanism contributing to cognitive and behavioral abnormalities observed in the patient. Although further studies are needed to better understand the molecular details of CB-mediated translational control, we suggest a model whereby CB, by physically interacting with mTOR and eIF3, sequesters these proteins, thereby preventing both the ability of mTOR to activate its targets and the formation of the translational initiation complex. In conclusion, our results offer new insights into the role of CB in protein synthesis control
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-15122014-142323 |
| Date | 11 August 2014 |
| Creators | Camila de Oliveira Freitas Machado |
| Contributors | Andrea Laurato Sertie Santos, Patricia Maria de Carvalho Aguiar |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Biológicas (Biologia Genética), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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