Ce projet vise à étudier, par une approche pluridisciplinaire, l’influence des la cristallisation des protéines membranaires (PM) en prenant pour protéine modèle le complexe photosynthétique RC-LH1-pufX de Rhodobacter blasticus. Des cristaux de ce complexe avaient été obtenus en présence de dodécyl-!-maltoside (DDM) et avaient diffractés à 8 Å de résolution. L’objectif final est de pouvoir améliorer, de façon rationnelle, la qualité des cristaux du complexe RC-LH1-pufX grâce à une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu. Dans un premier temps, trois tensioactifs dérivés du DDM ont été conçus et synthétisés. L’intérêt est d’augmenter la rigidité et le caractère lipophobe des parties hydrophobes des tensioactifs par rapport au DDM, pour les rendre moins déstabilisants envers la protéine: soit par l’incorporation d’un groupement bicyclohexyle (PCC-maltoside), soit par l’ajout d’un segment fluoré de longueur modulable (F4H5- et F2H9-maltoside). Nous avons inclus également le F8TAC, tensioactif fluoré utilisé depuis une vingtaine d’années pour le maintien en solution des PM, et les "tripodes", amphiphiles faciaux dont la géométrie particulière n’avaient jamais été testée. Nous avons ensuite réalisé la caractérisation physico-chimique, en solution, de ces tensioactifs et du DDM en terme de CMC (concentration micellaire critique), nombre d’agrégation, taille (par diffusion de la lumière dynamique, DLS), facteur de forme (par diffusion des rayons X aux petits angles, SAXS) et facteur de structure (par mesure du second coefficient du viriel, indicateur du potentiel des tensioactifs à initier la cristallisation)afin de déterminer les caractéristiques importantes au maintien en solution et à la cristallisation des PM. Le PCC-malt présentant le même comportement que le DDM,nous l’avons sélectionné pour réaliser une étude en présence de la protéine.Après avoir mis au point une méthode de dosage des tensioactifs par HPTLC (HighPerformance Thin Layer Chromatography) et identifier les lipides présents dans les de Rhodobacter blasticus, nous avons pu quantifier les quantités de lipides et de tensioactifs associés à la protéine en présence de DDM et de PCC-malt.Enfin, dans une dernière partie, nous avons réalisé des essais de cristallisation du complexe RC-LH1-pufX en présence des tensioactifs sélectionnés pour faire le lien entre les conditions de cristallisation et l’étude physico-chimique des micelles en solution. / Membrane proteins (MPs) are involved in the regulation of various fundamental cellular functions, such as cell recognition, receptor-mediated signal transduction and selective transportation of metabolites. However despite their huge importance, researches in MPs are relatively limited. For example MPs represent approximately 30% of the human proteome and less than 1% of current Protein Data Bank entries. Indeed, the presence of hydrophobic domains in MPs makes them not soluble in water. Therefore surfactants are used to extract MPs from their native environment and substitute for lipids around the transmembrane domain of the protein, forming water-soluble complexes. However MPs are often unstable in surfactant solution because of the intrusion of the alkyl chain of the surfactant into the transmembrane domain and/or the dissociation of stabilizing lipids, cofactors or subunits. Our project aims to study, through a multidisciplinary approach, the influence of surfactants for MP crystallization. Since dodecylmaltoside (DDM) is the most common gentle detergent used for MPs crystallization, we synthesized three new structurally DDM-derivative surfactants whose designs were expected to limit MPs inactivation. The objective was to increase the rigidity and the lipophobic behavior of the hydrophobic moiety by adding a bicyclohexyl group (PCC-maltoside) or using different lengths of fluorinated segments (F4H5- and F2H9-maltoside). Comparison of these surfactants with DDM occurs on:Physico-chemical properties: Surfactants are characterized by their CMC, molar mass (SEC-MALS, SAXS), hydrodynamic size (DLS), form factor (SAXS) and structure factor (A2, indicator of surfactant potential to lead to crystallization) in order to determine their best characteristics for MPs crystallization. Biochemical properties: We chose the RC-LH1-Puf X complex from Rhodobacter blasticus as model protein because of its biological interest. Besides this membrane protein has already been crystallized in DDM giving a low diffraction resolution (8Å). A better understanding of mechanisms involved in crystallization is a prerequisite for the development of rational approaches to increase crystals quality. Therefor protein complexes are characterized by quantifying lipids and surfactants bound to the transmembrane domain. Surfactant and lipid assays are performed by High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC). Crystallization trials: we show the link between crystallization and surfactants physico-chemical properties
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2013AVIG0250 |
| Date | 28 June 2013 |
| Creators | Barret, Laurie-Anne |
| Contributors | Avignon, Polidori, Ange, Jungas, Colette, Bonnete, Françoise |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, StillImage |
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