Magíster en Bioquímica área de Especialización en
Bioquímica de Proteínas Recombinantes / Memoria de título de bioquímico / Los sistemas de secreción tipo VI (T6SS) corresponden a un mecanismo de interacción
célula-célula ampliamente distribuido entre bacterias Gram negativo. Si bien inicialmente al
T6SS se le atribuyó un papel en la virulencia de los microorganismos, estudios posteriores
dieron cuenta de su versatilidad, indicando que el sistema también toma parte en relaciones
mutualistas o comensales entre bacterias y eucariontes, además de relaciones de competencia
interbacteriana.
Salmonella Typhimurium codifica un T6SS en la isla de patogenicidad SPI-6
(T6SSSPI-6), sin embargo el rol que cumple en la patogénesis de Salmonella aún no ha sido
aclarado. Resultados obtenidos en nuestro laboratorio indican que mutantes de este sistema
presentan una menor colonización de órganos internos, tanto en ratones BALB/c como en pollos
White Leghorn infectados oralmente. Considerando que los componentes celulares del sistema
inmune son la principal puerta de entrada de Salmonella para el desarrollo de la infección
sistémica, se planteó como hipótesis de este trabajo que “el Sistema de Secreción Tipo VI
codificado en la isla genómica SPI-6 de Salmonella enterica serovar Typhimurium se expresa en
el interior de macrófagos de origen murino y aviar, favoreciendo la supervivencia bacteriana en
estas células”. Para probar esta hipótesis el objetivo fue evidenciar la expresión, funcionalidad y
contribución del T6SS durante la interacción de S. Typhimurium con macrófagos murinos y
aviares.
Para determinar la expresión del T6SS durante la infección de macrófagos, se construyó
el vector pLZ01 que permitio la generación de fusiones transcripcionales y traduccionales a la
proteína fluorescente verde (GFP) en Salmonella, mediante recombinación homóloga de
productos de PCR. De esta manera, se fusionaron componentes estructurales del T6SSSPI-6
(VgrG, Hcp-1, Hcp-2) a GFP y se evaluó su transcripción y traducción en ensayos de infección
in vitro mediante microscopía de epifluorescencia. Por otra parte, para determinar si el sistema
es translocado al citoplasma de macrófagos durante la infección de S. Typhimurium, se estudió
la translocación de una fusión traduccional de VgrG a la β-lactamasa TEM1, construida en el
plasmidio pFlagTEM1. La translocación de las fusiones fue determinada mediante un ensayo de
pérdida de FRET de la cefalosporina CCF2, observado mediante microscopía de epifluorescencia y cuantificado mediante fluorometría. Finalmente, para determinar la
contribución del T6SS en los procesos de internalización y supervivencia en macrófagos se
realizaron ensayos de protección con gentamicina. En ellos se comparó la capacidad de la cepa
silvestre para invadir y sobrevivir en el interior de macrófagos, versus mutantes que carecen de
todo el T6SSSPI-6 o poseen un T6SSSPI-6 no funcional debido a la mutación de clpV, ATPasa
esencial para este sistema. Todos los experimentos se realizaron en líneas de macrófagos
murinos (RAW264.7) y aviares (HD11), utilizando cepas derivadas de S. Typhimurium 14028s.
Los resultados mostraron que ninguno de los componentes estructurales estudiados
(VgrG, Hcp-1, Hcp-2) del T6SSSPI-6 de S. Typhimurium se transcribe y traduce en el medio de
cultivo celular, sin embargo su transcripción y traducción es gatillada al infectar tanto
macrófagos murinos como aviares. A pesar de observar la transcripción y traducción de VgrG,
no se detectó su translocación al citoplasma de las células infectadas. Contrariamente a lo
esperado, se observó que la presencia del T6SSSPI-6 no contribuye a la supervivencia en el
interior de macrófagos murinos o aviares, pero sí tendría una implicancia en la etapa de
internalización de Salmonella, puesto que al utilizar mutantes con un T6SSSPI-6 no funcional se
observó un fenotipo de mayor internalización en ambos modelos celulares.
Estos resultados permiten aceptar una parte de la hipótesis planteada, ya que el Sistema
de Secreción Tipo VI codificado en la isla genómica SPI-6 de Salmonella enterica serovar
Typhimurium se expresa en el interior de macrófagos de origen murino y aviar, y rechazar una
segunda parte de la hipótesis, pues este sistema no tendría un rol en la supervivencia bacteriana
en estas células. No obstante, el aumento en la capacidad de internalización de mutantes del
T6SS indica que el sistema tendría un rol durante la infección de los macrófagos. / Type VI Secretion Systems (T6SS) correspond to a widely distributed cell-cell
interaction mechanism in Gram-negative bacteria. Although initially the T6SS was attributed a
role in the virulence of microorganisms, subsequent studies realized its versatility, indicating that
this system also takes part in comensal or mutualistic relationships between bacteria and
eukaryotes, as well as interbacterial competition.
Salmonella Typhimurium encodes a T6SS in the pathogenicity island SPI-6 (T6SSSPI-6),
however the role of this island in the pathogenesis of Salmonella has not been clarified. Results
obtained in our laboratory indicate that mutants of this system generate a phenotype of reduced
colonization of internal organs, both in orally infected BALB/c mice and White Leghorn
chicken. Because the initial contact of Salmonella with cellular components of the immune
system is the main gateway for the development of systemic infection of Salmonella, the
objective of this work was to determine the expression, functionality and contribution of the
T6SS during S. Typhimurium interaction with murine and avian macrophages.
The vector pLZ01was built to determine the expression of the T6SS during infection of
macrophages. This plasmid enables the generation of transcriptional and translational fusions to
the green fluorescent protein (GFP) reporter in Salmonella by homologous recombination of
PCR products. In this way, structural components of the T6SSSPI-6 (VgrG, Hcp-1, Hcp-2) were
merged to GFP and their transcription and translation were assessed by in vitro infection assays
and epifluorescence microscopy. On the other hand, to determine whether the system is
translocated to the cytoplasm of macrophages during infection of S. Typhimurium, translocation
of VgrG was studied using a translational fusion of VgrG to the β-lactamase TEM1, built in the
pFlagTEM1 plasmid. The translocation of the β-lactamase fusion was determined by processing
of the CCF2/AM fluorescence substrate, detected by epifluorescence microscopy and quantified
using fluorometry. Finally, gentamicin protection assays were performed to determine the
contribution of the T6SS in the processes of internalization and survival in macrophages. In these experiments, invasion and survive inside macrophages at the wild type strain was
compared to a deletion mutant of the T6SS gene cluster and a mutant on the clpV gene, which
encodes the ATPase essential for the functioning of the system, All experiments were carried out
in murine (RAW264.7) and avian (HD11) macrophage cell-lines, using strains derived from the
sequenced wild-type S. Typhimurium 14028s strain.
The results showed that none of the studied structural components (VgrG, Hcp-1, Hcp-2)
of T6SSSPI-6 of S. Typhimurium are produced in cell culture media, but their transcription and
translation are triggered when murine or avian macrophages are infected. Despite observing
transcription and translation of VgrG, translocation of this protein into the cytoplasm of infected
cells could not be detected. Contrary to expectations, it was observed that the presence of the
T6SSSPI-6 did not contribute to Salmonella survival within murine or avian macrophages.
However, internalization experiments showed that non-functional T6SSSPI-6 mutants showed a
greater uptake into both cellular models.
These results indicate that the T6SSSPI-6 of S. Typhimurium is expressed during infection
of murine and avian macrophages (the first part of the hypothesis is true), however it did not
have an impact on the ability of S. Typhimurium to survive inside murine or avian macrophages
(the second part of the hypothesis is false). However, the increase in the internalization of the
T6SS mutants suggests a novel role for the T6SS during infection of macrophages. / Fondecyt
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/113484 |
| Date | 01 1900 |
| Creators | Leiva Araya, Lorenzo Eugenio |
| Contributors | Contreras Osorio, Lucía Inés, Santiviago Cid, Carlos, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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