Genomic analysis of the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus revealed the presence of an open reading frame (ORF PF0356) similar to the enzymes in glycoside hydrolase family 1. This beta-glycosidase, designated PFTG (Pyrococcus furiosus thermostable glycosidase), was cloned and expressed in Escherichia coli. The expressed enzyme was purified by heat treatment and Ni-NTA affinity chromatography. The gene was composed of 1452 bp encoding 483 amino acids for a protein with a predicted molecular mass of 56,326 Da. The temperature and pH optima were 100°C and 5.0 in sodium citrate buffer, respectively. The substrate specificity studies by conventional assays showed characteristics of both beta-galactosidase and beta-mannosidase activities. However, through kinetic studies by ITC (Isothermal Titration Colarimetry), this enzyme showed the highest catalytic activity in p-nitrophenyl-beta-D-mannopyranoside (pNP-Man) with kcat/Km (3.02). The enzyme showed transglycosylation and transgalactosylation activities toward cellobiose, lactose and mannooligosaccharides, that could produce GOS (galactooligosaccharides) and MOS (mannooligosaccharides) which are the important prebiotic (bifidogenic) ingredients. Sequence alignments and homology modeling of PFTG showed that the residue 150 is conserved as tryptophan in beta-glycosidase and in other related enzymes such as beta-mannosidase and beta-galactosidase. To elucidate the relationship between the substrate size and geometric shape of the catalytic site of thermophilic beta-glycosidase and category of PFTG, the Q77, the Q150 and the D206 located at the interface of the dimer were replaced with Trp and Asn. Also, to confirm the role of active sites of PFTG, the Q77/150W double mutant was created through subcloning. The mutant enzymes were successfully cloned, expressed in E. coli and showed the same temperature and pH optima at 100 °C and pH 5.0, respectively. By substituting Gln150 to Trp and Gln77/150Trp, the catalytic efficiency (kcat⁄Km) of the mutants by ITC200 on both synthetic and natural substrates were slightly changed. As compared with the wild-type enzyme, substrate specificities on the mutant enzymes were similar but with more affinity (Km) to substrates and low turnover number (kcat). To confirm the category of PFTG, the protein structural studies were performed. After the wild-type enzyme was purified, the enzyme was set up for protein crystal screening under 200 different conditions. With several hit conditions, X-ray diffraction study was performed, but during the X-ray analysis, the data was too high to obtain the reasonable data. Through protein sequence analysis of PFTG, two Lys-Lys sequences which interfere the protein crystallization were revealed. After Lys-Lys amino acids were mutated to Ala-Ala by site-directed mutagenesis, the mutant enzymes were set up and incubated for crystallization. Clear protein crystals were not obtained, but the computer 3D model structure indicated that this enzyme was similar to that of beta-glycosidase from Thermosphaera aggregans. / L'analyse génomique de la Pyrococcus furiosus, hyperthermophile archaeon a révélé la présence d'un cadre de lecture ouvert (ORF PF0356) similaire aux enzymes de la famille glycoside hydrolase 1. L'enzyme beta-glycosidase, désigné PFTG (Pyrococcus furiosus glycosidase thermostable), a été cloné et exprimé dans Escherichia coli. L'enzyme exprimée a subi un traitement thermique et a été purifié par une chromatographie d'affinité au nickel. Son gène a une taille de 1452 pb et code pour une protéine de 483 acides aminés. Sa masse moléculaire prédite est de 56,326 Da. Les conditions optimales de l'activité de cette enzyme ont été définies dans un tampon citrate de sodium à pH 5,0 et à une température de 100 °C. Les études de spécificité du substrat ont démontré des caractéristiques similaires aux activités enzymatiques de la beta-galactosidase et de beta-mannosidase. À partir des résultats obtenues de cinétique par ITC (titration isotherme colarimetry), cette enzyme a révélé avoir une activité catalytique la plus élevé pour le substrat p-nitrophényl-beta-D-mannopyranoside (pNP-Man) avec un ratio Kcat/Km de 3,02. L'enzyme a montré avoir des activités de transglycosylation et de transgalactosylation envers le cellobiose, le lactose ainsi que les mannooligo-saccharides. Ce qui pourraient produire des GOS (galacto oligosaccharides) et des MOS (mannooligosaccharides) qui sont d'importants ingrédients prébiotiques (bifidogène). Les alignements de séquences et de modélisation par homologie de la PFTG ont révélé que le résidu 150, qui est le tryptophane, est conservé dans la beta-glycosidase ainsi que dans d'autres enzymes apparentés tels que la beta-galactosidase et le beta-mannosidase. Pour élucider la relation entre la taille du substrat et la forme géométrique du site catalytique de l'enzyme thermophilique beta-glycosidase ainsi que la catégorie de PFTG, les acides aminés Gln 77, Gln 150 et Asp 206 situées à l'interface du dimère ont été remplacés par mutagenèse dirigée. Ainsi, le tryptophane a été substitué aux résidus Gln 77 et 150 et l'asparagine a été substituée au résidu Asp 206. De plus, le double mutant Q77/150W a été créé par sous-clonage pour confirmer le rôle des sites actifs de PFTG. En effet, le gène PFTG de type sauvage a été muté, cloné puis exprimé dans E. coli. L'enzyme mutante exprimée à démontrer la même activité dans les mêmes conditions que l'enzyme natif, soit de tampon, de température et de pH. En substituant Gln150 et Gln77 par des tryptophanes, l'efficacité catalytique (Kcat/Km) du mutant mesuré par ITC200 a été légèrement modifié sur les substrats synthétiques et naturels. En comparant avec l'enzyme natif, la spécificité de l'enzyme mutant pour les substrats a été similaire mais avec une plus grande affinité (Km) pour les substrats et un faible Kcat. Pour confirmer la catégorie des PFTG, des études sur la structure de la protéine ont été effectuées. Après avoir purifié l'enzyme de type sauvage par chromatographie d'affinité au nickel et par chromatographie sur gel (GPC), l'enzyme purifiée a été préparée à des fins de dépistage de cristaux et mis à l'épreuve dans les 200 conditions différentes.Au cours des analyses aux rayons X, les données du facteur de diffraction se sont avérées trop élevés pour donner des résultats significatifs. Par contre, l'analyse de séquence protéique de la PFTG native a révélé deux liaisons Lys-Lys qui ont entravé la cristallisation de la protéine. Après que la liaison d'acides aminés Lys-Lys a été substituée par une liaison Ala-Ala par mutagenèse dirigée, l'enzyme mutant a été conduit à des analyses de cristallographie. Il n'a pas été possible d'obtenir des cristaux de protéine. Par contre, la modélisation par ordinateur de la structure 3D a indiqué que cette enzyme est similaire à celle de la beta-glycosidase de Thermosphaera aggregans.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.97062 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Park, Sung-Hoon |
| Contributors | Inteaz Alli (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Food Science and Agricultural Chemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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