Complexes of the bovine whey protein alpha-lactalbumin and oleic acid that have been reported to have cytotoxic effects against tumor cells but not against healthy cells are of potential interest as new ingredients for functional foods. Understanding the relationship between the structures of the protein and lipid in alpha-lactalbumin-oleic acid complexes, as mediated by the conditions employed in their preparation, and their efficacy as cytotoxic agents against tumor cells is an important prerequisite for the production of such ingredients. The overall aim of the present study was to advance our understanding of this relationship by characterizing alpha-lactalbumin-oleic acid samples prepared under various pH and temperature conditions. Biophysical techniques were employed to examine the secondary and tertiary structures of alpha-lactalbumin, its oligomerization, and the charge state of oleic acid under these conditions. The data obtained were related to the cytotoxicity of these samples against the lymphocytic leukemia (L1210 mouse) cell line, as measured by a cell viability assay. Samples examined were prepared by dissolving millimolar quantities of food-grade alpha-lactalbumin and oleic acid in 25 mM sodium phosphate buffer at pH values: 6.5, 7.4, and 8.5, in order to provide different charge and physical states of oleic acid, and holding at 25, 50, 60, 70, or 80oC for 20 min. The Fourier transform infrared (FTIR) spectra of the samples showed that the oleic acid was in protonated form in the pH 6.5 samples, partly protonated and partly ionized in the pH 7.4 samples, and fully ionized in the pH 8.5 samples. The content of lipid relative to the protein was highest in the samples prepared at pH 8.5 and lowest in those prepared at pH 6.5. Electrospray ionization-mass spectrometric analysis confirmed that the samples prepared in this manner contained oleic acid bound to alpha-lactalbumin, with a binding ratio of up to 10 molecules of the fatty acid per monomer of the protein. FTIR spectroscopy and C:N-analysis showed that the number of lipid (oleic acid + oleate) molecules physically associated with the protein in these samples was much higher. At a concentration of 10 mg/mL, under the conditions of the cell viability assay, the alpha-lactalbumin-oleic acid samples prepared at pH 6.5 had the highest cytotoxicity against the L1210 cell line and the samples prepared at pH 8.5 were not cytotoxic. The cytotoxicity of the alpha-lactalbumin-oleic acid samples prepared at pH 6.5 and pH 7.4 was influenced by their preparation temperature and was highest in samples prepared at 60oC. In assays conducted in parallel with pure oleic acid and pure alpha-lactalbumin, the protonated form of oleic acid demonstrated a cytotoxic effect against the cell line that was independent of the preparation temperature, while neither the ionized form of oleic acid nor the pure protein had a cytotoxic effect. These results confirmed the findings of several other studies that oleic acid is the cytotoxic component in alpha-lactalbumin-oleic acid complexes. Thus, the charge state of the lipid, its concentration in the alpha-lactalbumin-oleic acid samples, and the preparation temperature conditions relative to the transition temperatures of the protein were identified as the combination of factors that influenced the cytotoxic effect on the tumor cell line under the conditions employed. By demonstrating preparation conditions whereby alpha-lactalbumin-oleic acid samples cytotoxic to a tumor cell line could be prepared from food-grade alpha-lactalbumin in millimolar quantities using a heat treatment process that could be adapted to commercial production, the present study has directed the study of cytotoxic alpha-lactalbumin-oleic acid complexes to the field of food science. / Les complexes d'alpha-lactalbumine (protéine de lactosérum bovin) et d'acide oléique, rapportés pour avoir des effets cytotoxiques sur des cellules tumorales, mais pas sur les cellules saines, ont un potentiel très intéressant en tant que nouvel ingrédient pour les aliments fonctionnels. La compréhension de la relation entre les structures de la protéine et des lipides dans les complexes alpha-lactalbumine-acide oléique en fonction des conditions de préparation, d'une part, et leur efficacité comme agents cytotoxiques contre les cellules tumorales, d'autre part, est une condition préalable importante pour la production de ces ingrédients. L'objectif global de la présente étude était de faire progresser notre compréhension de cette relation par la caractérisation des échantillons d'alpha-lactalbumine-acide oléique préparés sous diverses conditions de pH et de températures. Différentes techniques biophysiques utilisées pour étudier les structures secondaires et tertiaires et l'oligomérisation de l'alpha-lactalbumine ainsi que l'état de charge de l'acide oléique dans ces conditions, ont permis de relier les résultats aux données obtenues pour la cytotoxicité de ces échantillons par rapport à la lignée cellulaire souris à leucémie lymphocytaire (L1210), par l'entremise d'un test de viabilité cellulaire. Des quantités millimolaires d'alpha-lactalbumine de grade alimentaire et d'acide oléique ont été dissoutes dans un tampon phosphate de sodium 25 mM à pH: 6,5, 7,4, et 8,5, afin de fournir différentes charges et états physiques à l'acide oléique, et les échantillons ainsi préparés ont été maintenus à des températures de 25, 50, 60, 70, ou 80°C pendant 20 min. Les échantillons étudiés par la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) ont montré que l'acide oléique était entièrement protoné dans les échantillons à pH 6,5, partiellement protoné et partiellement ionisé dans les échantillons à pH 7,4, et complètement ionisé dans les échantillons à pH 8,5. Le ratio lipide:protéine assujetti au pH de préparation a augmenté dans l'ordre suivant: pH 6,5 <pH 8,5 < pH 7,4. L'analyse par ionisation par éléctronébuliseur couplé à un spectromètre de masse a confirmé que les échantillons ainsi préparés contiennent de l'acide oléique lié à l'alpha-lactalbumine, avec un taux de liaison d'un maximum de 10 molécules d'acide gras par monomère de protéine, alors que les analyses de C:N ainsi que les spectres FTIR ont montré que le nombre de molécules de lipides (acide oléique + oléate) physiquement associées à la protéine dans ces échantillons était beaucoup plus élevé. Lors de test de la viabilité des cellules, et à une concentration de 10 mg/mL, les échantillons d'alpha-lactalbumine-acide oléique préparés à pH 6,5 avaient la plus forte cytotoxicité contre la lignée cellulaire L1210 alors que les échantillons préparés au pH 8,5 n'étaient pas cytotoxiques. La cytotoxicité des échantillons d'alpha-lactalbumine-acide oléique préparés à pH 6,5 et pH 7,4 a été influencée par la température de leur préparation et elle était la plus élevée pour les échantillons préparés à 60oC. Dans des essais menés en parallèle avec de l'acide oléique pur et alpha-lactalbumine pure, la forme protonée de l'acide oléique a montré un effet cytotoxique contre la lignée cellulaire qui est indépendant de la température de préparation. Ni la forme ionisée de l'acide oléique, ni la protéine pure n'avaient un effet cytotoxique. Ces résultats confirment les conclusions de plusieurs autres études, c'est-à-dire que l'acide oléique est le composant cytotoxique dans des complexes d'alpha-lactalbumine-acide oléique. Ainsi, l'état de charge du lipide, sa concentration dans les échantillons d'alpha-lactalbumine-acide oléique, et les conditions de température de préparation par rapport aux températures de transition de la protéine ont été identifiées comme étant la combinaison de facteurs qui a influencé l'effet cytotoxique du complexe sur les lignées cellulaires tumorales.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.121137 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Nsonzi, Frances |
| Contributors | Ashraf A Ismail (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Food Science and Agricultural Chemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses |
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