The stabilization and immobilization of laccase enzymatic extract, obtained from Coriolus hirsutus, and its biocatalysis in organic solvent media (OSM) for the synthesis of selected oligophenols, were investigated. Among the investigated lyopotectants, 2.5% mannitol was found to be the most appropriate one, where the stability of the laccase lyophilized extract was greatly enhanced, with 96.2, 38.9 and 24.7% of residual activity after 4 weeks of storage at -80, 4 and 25°C, respectively. Using syringaldazine (SG) as substrate, the free laccase showed its highest catalytic activity only in the ternary micellar system (TMS), composed of sodium acetate buffer/hexane and AOT, but not in the mono- or biphasic ones. Under the optimum conditions, the relative laccase activity in TMS was found to be 84.0% as compared to that in the aqueous medium. The results also demonstrated that 50% of the residual laccase activity was obtained after 56.8, 14.7, 8.5 and 5.0 h of incubation at 4, 25, 37 and 50ºC, respectively. The kinetic studies indicated that the Km value for laccase was 15.8, 15.8, 26.1, 44.4, 69.3, 80.5 and 330.0 µM, using sinapic acid, m-coumaric acid, ferulic acid, SG, 2,6-dimethoxyphenol, caffeic acid and 2,2ʹ-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt or ABTS, respectively, with the corresponding relative percent kcat values of 8.2, 7.0, 3.8, 1.6, 1.0, 6.8 and 0.1. Using ferulic acid (FA) as the substrate model, the optimization of laccase immobilization by physical adsorption, covalent binding and encapsulation showed that the encapsulation of the enzyme into Ca-alginate was the most appropriate approach. The highest immobilization yield of 60.9% and the residual laccase activity of 62.6% were obtained when the enzyme extract was immobilized with 1.5% (w/v) alginate and 100 mM CaCl2 at 1.5 mg/mL initial protein load. The encapsulated laccase exhibited an increase in its activity in OSM as compared to that in the aqueous one. Moreover, the encapsulated laccase was stable when it was dehydrated with iso-propanol and acetone, with 114.0 and 100.6% of residual activity, respectively; it retained 60.8 and 74.9% of its initial activity, after 24 h of its incubation at 55°C, in the aqueous and hexane medium. The encapsulated laccase also maintained 25.6 and 76.4% of its residual activity after 6 cycles of reaction in aqueous and hexane medium, respectively. The characterization of the laccase-catalyzed end products was obtained by size-exclusion chromatography (SEC), high-performance liquid chromatography (HPLC), spectrophotometric, Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR), pyrolysis/gas liquid chromatography/mass spectrometry (Py/GC/MS) and mass spectrometry (MS) analyses. The results showed that the biocatalysis of laccase in aqueous medium resulted in the synthesis of three end products, identified as di-, tri- and tetramer of FA with a molecular weight (MW) of 386.4, 578.5 and 770.7 Da, respectively; however, only the dimers of FA were obtained in OSM, with a MW of 386.4 Da. The FTIR and MS analyses indicated that the polymerization of FA involved the C-O coupling modes in the aqueous medium. The pyrograms showed that the dimers, obtained in OSM, were more stable than all the end products obtained in the aqueous medium. The dimers, obtained in the OSM, demonstrated also the highest oxygen-radical absorbance capacity (ORAC) value, with 2.7 and 14.5-fold higher than that for FA and for its dimers, obtained in the aqueous medium, respectively. / La stabilité et l'immobilisation de l'extrait enzymatique contenant la laccase, obtenu de Coriolus hirsutus, et sa biocatalyse dans un milieu réactionnel de solvants organiques (OSM) pour la synthèse des oligophenols sélectionnés, ont été étudiés. Parmi les différents lyoprotectants utilisés, 2.5% mannitol a été jugée le plus approprié, où la stabilité de l'extrait lyophilisé de la laccase a été énormément amélioré, avec 96,2, 38,9 et 24,7% d'activité résiduelle après 4 semaines d'entroposage à -80, 4 et 25°C, respectivement. En utilisant la syringaldazine (SG) comme substrat modèle, la laccase a seulement montré une activité catalytique dans le milieu micellaire ternaire, composé du tampon d'acétate de sodium/ hexane et l'AOT, mais pas dans les milieux mono- ou bi-phasiques. Sous les conditions optimales, l'activité de la laccase dans le milieu micellaire ternaire a été de 84,0% relativement à celle obtenu dans le milieu aqueux. Les résultats ont également démontré que dans le milieu micellaire ternaire 50% de l'activité résiduelle de la laccase a été obtenu après 56,8, 14,7, 8.5 and 5,0 h d'incubation à 4, 25, 37 et 50ºC, respectivement. Les études cinétiques ont indiqué que la valeur de Km pour la laccase a été de 15,8, 15,8, 26,1, 44,4, 69,3, 80,5 et 330.0 µM, en utilisant l'acide sinapique, l'acide m-coumarique, l'acide férulique, la SG, le 2,6-dimethoxyphenol, l'acide cafféique et le sel diammonium 2,2`-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acide) ou l'ABTS, respectivement, avec les valeurs correspondantes relatives de kcat de 8,2, 7,0, 3,8, 1,6, 1,0, 6,8 et 0,1. L'utilisation de l'acide férulique (FA) comme substrat modèle, l'optimisation de l'immobilisation de la laccase par adsorption physique, liaison covalente et encapsulation a démontré que l'approche la plus appropriée était l'encapsulation de l'enzyme avec l'alginate de calcium. Le rendement d'immobilisation (60,9%) et l'activité résiduelle (62,6%) les plus élevés ont été obtenue lorsque l'extrait enzymatique a été immobilisé avec 1,5% (p/v) d'alginate, 100 mM CaCl2 et 1,5 mg/mL de quantité initiale de protéine. La laccase encapsulée présente une augmentation de son activité dans l'OSM par rapport à celle dans le milieu aqueux. En outre, la laccase encapsulée présente une haute stabilité quand elle est déshydratée avec de l'iso-propanol et l'acétone, en conservant 114,0 et 100,6% de son activité, respectivement. De plus, elle a retenu 60,8 et 74,9% de son activité initiale, après 24 h d'incubation à 55°C, dans le milieu aqueux et l'hexane. Également, la laccase encapsulée a maintenu 25,6 et 76,4% de son activité initial après 6 cycles de réaction en milieux aqueux et l'hexane, respectivement. La caractérisation des produits finaux obtenus par l'oxydation du FA par la laccase a été faite par des analyses de chromatographie d'exclusion stérique (SEC), chromatographie en phase liquide a haute performance (HPLC), spectrophotométrie, spectroscopie infrarouge a transformée de Fourier (FTIR), la pyrolyse couplée à la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse (Py/GC/MS), la chromatographie liquide ainsi que par spectrométrie de mass (MS). Les résultats ont montré que la biocatalyse de la laccase dans un milieu aqueux, mène à la synthèse de produits finaux différents identifiés comme des di-, tri- et tétramère du FA avec des poids moléculaires (MW) de 386,4; 578,5 et 770,7 Da, alors que dans le OSM, seuls des dimères du FA de PM 386.4, ont été obtenu. L'analyse de FTIR ainsi que ceux du MS ont démontré que la polymérisation du FA dans le milieu aqueux implique les modes de couplage C-O. Les pyrogrammes ont démontré que les dimères, obtenus dans l'OSM sont plus stables que les ceux obtenus dans le milieu aqueux. Les dimères, obtenus dans l'OSM, ont démontré une capacité d'absorption des radicaux oxygénés (ORAC) avec des valeurs de 2,7 et 14,5 fois plus élevées que ceux du FA et les dimères obtenus dans le milieu aqueux, respectivement.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.119558 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Bou Mitri, Christelle |
| Contributors | Selim Kermasha (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Food Science and Agricultural Chemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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