The production of the fructosyltransferase (levansucrase) by the thermophilic strain Geobacillus stearothermophilus was investigated at 55oC over a 32 hr-fermentation time course in a mineral medium supplemented with varying sources of nitrogen, iron and carbon inducers. Both organic nitrogen sources, tryptone and peptone, provided the maximal microbial growth and levansucrase activity. All carbon sources induced the production of levansucrase activity, but sucrose at 1% (w/v) was the most efficient inducer. The supplementation with ferrous and ferric iron sources had no significant effect on the bacterial growth nor on the levansucrase activity. The selected culture medium for the large enzyme recovery was composed of peptone/tryptone mixture (5 g/L, each), FeSO4 (5 mg/L) and 1% sucrose. Bacterial cells were harvested after 9hr-fermentation period, which corresponded to a specific levansucrase activity of 1.23 U/mL/Abs600nm. The crude levansucrase extract was enriched using selected precipitating agents. The results show that (NH4)2SO4 (50% saturation) and MnCl2 (50 mM), provided the highest purification factor of 2.44- and 3.16-fold with a recovery yield of 29.3 and 43.9%, respectively. Although PEG-200 and PEG-400 resulted in exceptional purification factors ranging from 231 to 394, the recovery yields were very poor (5.7%). A two-step purification process combining Superdex 75 and MonoQ 5/50 columns resulted in a purification factor of 28.4 and a final yield of 71%. The gel filtration chromatography of the native levansucrase revealed it to be a monomer of 54.4 kDa. The purified levansucrase showed activity over a broad range of temperature (4-67oC) and pH (4-8). However, the transfructosylation and hydrolytic activities were optimal at 47-57oC and at 57oC, respectively, and the transfructosylation activity over the hydrolytic one (2.86 to 3.18 ratio) was favoured within a narrow pH range of 6.0 to 6.5. In addition, the transfructosylation and hydrolytic activities of levansucrase retained 91.7% and 100% of the initial activity after 6 hr-incubation time at 47oC, but were completely inhibited at higher temperatures. The saturation curve of levansucrase activity using sucrose showed typical Michaelis Menten behavior. However, the relatively high Kmapp values for transfructosylation (269 mM) and hydrolytic (272 mM) activities indicate the low affinity of the enzyme towards sucrose. Yet, the levansucrase revealed to have higher acceptor specificity towards pyranose- than furanose-containing glycosides. / La production de la fructosyltransférase (lévansaccharase) par la souche thermophilique Geobacillus stearothermophilus a été investiguée à 55oC pendant 32 h de fermentation dans un milieu de culture minéral supplémenté avec diverses sources d'azote, de fer et de carbones pour l'induction. Les sources d'azotes organiques, tryptone et peptone, ont conduit à une croissance bactérienne optimale et une production maximale de la lévansaccharase. Toutes les sources de carbones utilisées sont parvenues à induire la production de la lévansaccharase, avec le saccharose (1% m/v) étant l'inducteur le plus efficace. L'addition d'une source férrique ou ferreuse n'a eu aucun effet significatif ni sur la croissance bactérienne ni sur la production de la lévansaccharase. Le milieu de culture optimal déterminé pour la production maximale de la lévansaccharase est composé d'un mélange de tryptone/peptone (5 g/L, chacun), FeSO4 (5 mg/L) et 1% saccharose. Les cellules bactériennes ont été récoltées après une période de fermentation de 9 h, correspondant à une activité spécifique de lévansaccharase de 1.23 U/mL/Abs600nm. L'extrait brut de lévansaccharase a été concentré avec des agents de précipitation sélectionnés. Les résultats démontrent que le (NH4)2SO4 (saturation de 50%) et le MnCl2 (50 mM) fournissaient les facteurs de purification les plus élevés de 2.44 and 3.16 avec un rendement de 29.3 et 43.9%, respectivement. Bien que l'utilisation de PEG-200 et PEG-400 démontraient des facteurs de purification exceptionnels variant entre 231 à 394, les rendements étaient très faibles (5.7%). Un procédé de purification en 2 étapes, combinant les colonnes Superdex75 et MonoQ5/50, a permis de purifier la lévansaccharase 28.4 fois avec un rendement final de 71%. La chromatographie par filtration en gel a révélé que la lévansaccharase est un monomère d'un poids de 54.4 kDa. La lévansaccharase purifiée a démontré une activité à travers un intervalle étendu de température (4-67oC) et de pH (4-8). Par contre, les activités de transfructosylation et d'hydrolyse étaient maximales à 47-57oC et à 57oC, respectivement, avec une préférence pour l'activité de transfructosylation par rapport à l'hydrolyse (ratio de 2.86 à 3.18) à l'intérieur d'un étroit intervalle de pH de 6.0 à 6.5. De plus, les activités de transfructosylation et d'hydrolyse ont conservé 91.7% et 100% de leurs activités initiales après une période d'incubation de 6h à 47oC, mais ont été complètement inhibées à de plus hautes températures. La courbe de saturation de l'activité de la lévansaccharase avec le saccharose illustre un modèle typique de Michaelis-Menten. Par contre, la valeur élevée de Kmapp pour la transfructosylation (269 mM) et l'hydrolyse (272 mM) indique la faible affinité de la lévansaccharase pour le saccharose. Néanmoins, la lévansaccharase a démontré une spécificité plus élevée envers des accepteurs glycosidiques pyranosidique que ceux furanosiques.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.97041 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Inthanavong, Lotthida |
| Contributors | Salwa Karboune (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Food Science and Agricultural Chemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
Page generated in 0.003 seconds