The investigation of exo-laccase production by selected fungal strains, including Coriolus hirsutus, Pleurotus pulmonarius and Chaetomium thermophilium, under liquid-state fermentation was investigated. Among the investigated fungal strains, C. hirsutus found to be the most appropriate one in term of its capacity to produce active exo-laccase in the presence of ethanol as the most appropriate inducer. The effects of carbon and nitrogen concentrations on the production of active laccase were also investigated, where 50 mM of glucose and 5 mM of ammonium chloride were found to be respectively, the optimized concentrations. The exo-crude enzymatic extract was recovered and concentrated by ultrafiltration; the partially purified enzymatic extract was obtained by ammonium sulfate precipitation at 60-80% of saturation. The partially purified enzymatic extract of laccase was successively purified by size-exclusion (SEC) and ion-exchange (IEC) chromatographies. The SEC resulted by obtaining one enzymatic fraction, whereas the IEC resulted by the presence of 5 fractions. Although laccase activity was present in all the purified enzymatic fractions, FV1 showed the highest laccase specific activity, with 3% yield and 33-fold of purification. The denatured electrophoretic analysis of the purified enzymatic fraction (FV1) demonstrated the presence of two major protein bands, with a molecular weight of 31 and 56 kDa. The characterizations of the purified enzymatic fraction (FV1) indicated an optimum pH for laccase activity at 2.2, 2.6, 3.8 and 4.8 for 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), 2,6-dimethoxyphenol (DMP), caffeic acid and syringaldazine (SYR), respectively, used as substrates, with an optimum reaction temperature of 60C. The FV1 purified fraction showed an affinity trend in the order of SYR > ABTS > caffeic acid > DMP, with a Km value of 6, 13, 26, 821 µM and a Vmax value of 37, 296, 6 and 71 µM/mg protein/min, respectively, at a reaction temperature of 60°C. In addition, the presence of 0.04 mM copper sulfate enhanced the laccase activity of the purified enzymatic fraction by 19%. On the other hand, the presence of 0.005 to 0.04 mM of citric acid did not affect the laccase activity of the purified enzymatic fraction; whereas, a concentration of 0.08 and 0.12 mM inhibited the enzyme activity by 8 and 13%, respectively. Interestingly, the experimental findings indicated that 0.04 mM sodium azide strongly inhibited the laccase activity of the purified enzymatic fraction by 97%. The effect of citric acid and sodium azide on the laccase activity of the purified enzymatic fraction (FV1) was investigated at room temperature. The Km and Vmax values for the purified laccase, with SYR as a substrate, were determined to be 10 µM and 26 µM/mg protein/min, respectively, at room temperature. Citric acid and sodium azide exhibited an uncompetitive inhibitory effect on laccase activity as indicated by their corresponding Kmapp and Vmaxapp of 8 µM and 20 µM/mg protein/min and 7 µM and 6 µM/mg protein/min, respectively. The mass spectrometry analyses of laccase of the purified enzymatic fraction (FV1) suggest the presence of several laccases in the fraction. The laccase A of the Trametes species AH28-2 was identified with 10 peptides and represents the protein with the higher proportion in the sample. However, other proteins with a laccase function were also presented in the sample. / La production de l'exo laccase par des souches fongiques sélectionnées dont Coriolus hirsutus, Pleurotus pulmonarius et Chaetomium thermophilium a été étudié avec fermentation en phase liquide. Parmi les souches fongiques étudiées, C. hirsutus a été trouvé pour être la plus potentielle en termes de sa capacité de produire activement l'exo laccase en présence de l'inducteur le plus approprié, l'éthanol. Les effets des concentrations en carbone et en azote sur la production de la laccase active ont été aussi étudiés où 50 mM de glucose et 5 mM de chlorure d'ammonia ont été trouvés pour être les concentrations optimales, respectivement. L'extrait enzymatique brut exo a été récupéré et concentré par l'ultrafiltration; l'extrait enzymatique partiellement purifié de la laccase a été obtenu par précipitation avec du sulfate d'ammonia saturé à 60-80%. L'extrait enzymatique partiellement purifié de la laccase a été par la suite purifié successivement par chromatographie d'exclusion-diffusion (SEC) et chromatographie sur échangeurs d'ions (IEC). La SEC a permis d'obtenir une seule fraction enzymatique alors que la IEC a donné lieu à 5 fractions purifiées. Bien que l'activité de la laccase a été présente dans toutes les fractions enzymatiques purifiées, la fraction FV1 a montré activité spécifique la plus élevée avec un rendement de 3% et une purification de 33 fois. L'analyse par électrophorèse dénaturée de le fraction FV1 a montré la présence de deux bandes de protéines majeures avec une masse moléculaire de 31 et 56 kDa. La caractérisation de la fraction enzymatique purifiée (FV1) a indiqué un pH optimum pour l'activité de la laccase à 2,2, 2,6, 3,8 et 4,8 avec 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), 2,6-dimethoxyphenol (DMP), acide caféique et syringaldazine (SYR), respectivement, utilisés comme substrats, et d'une température de réaction optimale de 60°C. La fraction purifiée FV1 a montré une affinité selon l'ordre suivant SYR > ABTS > acide caféique > DMP, avec une valeur Km de 6, 13, 26, 821 µM et de Vmax de 37, 296, 6 et 71 µM/mg protéine/min, respectivement, à une température de réaction de 60°C. De plus, la présence de 0,04 mM de sulfate de cuivre a augmenté l'activité de la fraction enzymatique purifiée de la laccase par 19%. D'autre part la présence de 0,005 à 0,04 mM de l'acide citrique n'a pas affecté l'activité de la fraction enzymatique purifiée tandis qu'une concentration de 0,08 et 0,12 mM a inhibé cette activité par 8 et 13%, respectivement. Les résultats expérimentaux ont aussi indiqué que 0,04 mM de sodium azide a fortement inhibé l'activité de la fraction enzymatique de la laccase par 97%. L'effet de l'acide citrique et du sodium azide sur l'activité de la fraction enzymatique purifiée de la laccase a été étudié en température ambiante. Les valeurs de Km et Vmax de la laccase purifiée, avec SYR comme substrat, ont été déterminées pour être 10 µM et 26 µM/mg protéine/min, respectivement, en température ambiante. L'acide citrique et sodium azide ont manifesté un effet inhibiteur non compétitif sur l'activité de la laccase comme indiqué par leur Kmapp et Vmaxapp correspondante de 8 µM and 20 µM/mg protéine/min and 7 µM and 6 µM/mg protéine/min, respectivement. Les analyses par spectrométrie de masse de la fraction enzymatique purifiée de la laccase (FV1) a suggéré la présence de plusieurs laccases. L'espèce Trametes AH28-2 de la laccase A a été identifiée avec 10 peptides et représente de la protéine avec la plus élevée dans l'échantillon. Cependant, autres protéines avec la fonction de laccase ont été aussi présentes dans l'échantillon.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.107685 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Taqi, Marwa |
| Contributors | Selim Kermasha (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Food Science and Agricultural Chemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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