O uso de resíduos agrícolas como fonte de carbono para a geração de energia renovável parece uma solução promissora para reduzir nossa dependência em combustíveis fósseis. Na natureza, como na compostagem, comunidades microbianas formam redes metabólicas complexas que degradam eficientemente a biomassa disponível através de um conjunto de enzimas sinérgicas. Entretanto, a desconstrução da lignocelulose continua uma desafio para a indústria devido a natureza recalcitrante do substrato e a baixa atividade das enzimas, aumentando o preço do biocombustível produzido. Estudos de metagenômica e metatranscriptômica de comunidades microbianas complexas tornam possível acessar as funções metabólicas empregadas por consórcios lignocelulolíticos e revelar novos biocatalisadores que podem melhorar a conversão industrial da lignocelulose. Aqui, através de uma abordagem metagenômica, foi examinada a diversidade de microrganismos obtidos em condições laboratoriais quando um meio definido ou um complexo foi usado no seu crescimento. Em seguida, a comunidade microbiana derivada de compostagem foi crescida em meio mínimo com bagaço de cana-de-açúcar como única fonte de carbono. A degradação do substrato foi monitorada e o metatranscriptoma da cultura resultante foi sequenciado, seguido pela seleção e caracterização funcional de vários alvos. Durante as cinco semanas de estudo, a comunidade microbiana crescida em meio mínimo mostrou maior diversidade e enriquecimento em microrganismos capazes de degradar a lignocelulose do que a comunidade microbiana crescida no meio complexo. A partir do metatranscriptoma foi descoberta a primeira hidrolase de glicosídeo da família 11 com atividade exoxilanase (C21). A estrutura cristalográfica da C21, refinada à 1,76 Å, revelou que a atividade exoxilanase observada se deve a presença de duas alças que não estão presentes nas demais estruturas dos membros da família 11 de hidrolase de glicosídeo depositadas até então. A adição da C21 a um coquetel comercial provocou um aumento na velocidade de hidrólise do Avicel quando na presença de xilooligômeros. As análises metagenômica e metatranscriptômica da comunidade microbiana proveniente da compostagem revelaram que o uso de um meio definido pode deslocar espécies generalistas, levando a uma fonte enriquecida para explorar enzimas com aplicação biotecnológica. Também demonstrou a diversidade de mecanismos envolvidos na degradação in situ da lignocelulose. / Using of the globally abundant crop residues as carbon source for energy generation seems a promising solution to reduce our dependency on fossil fuels. In nature, such as in compost habitats, microbial communities create complex metabolic networks that efficiently degrade the available plant biomass using a set of synergistic enzymes. However, deconstruction of lignocellulose remains a challenge for industry due to recalcitrant nature of the substrate and enzymes low activity, raising the price of the produced biofuel. Metagenomics and metatranscriptomics studies on complex microbial communities can assess the metabolic functions employed by the lignocellulolytic consortia and unveil novel biocatalysts that could improve industrial lignocellulose conversion. Here, using 16S rRNA amplicon metagenomic approach, we examined the diversity of microorganisms obtained in the laboratory setting when a nutrient-limited or nutrient-rich media are used. Then, a microbial community derived from compost was grown in minimal medium with sugarcane bagasse as a sole carbon source. The substrate degradation was monitored and the metatranscriptome from the resulting cultures was sequenced; several target genes were selected and functional characterized. During a five-week time course, the microbial community grown in minimal medium showed greater diversity and enrichment in lignocellulose-degrading microorganisms than the one grown in nutrient rich medium. Metatranscriptomics analysis revealed the first glycoside hydrolase from family 11 with exo-xylanase activity (C21). C21 crystal structure, refined at 1.76 Å, explained the molecular basis of exo-xylanase activity due to two extra loops previously unseen in the other reported structures from members from glycoside hydrolase family 11. A supplementation of commercial enzyme mix with C21 showed improvement in Avicel hydrolysis in the presence of inhibitory xylooligomers. The combination of metagenomic and metatranscriptomic analysis of compost-derived microbial community showed that nutrient-limited medium may displace bacterial generalist species, leading to an enriched source for mining novel enzymes for biotechnology applications. It also unveiled a diversity of mechanisms involved in lignocellulose degradation in situ.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-21092017-104026 |
| Date | 23 August 2017 |
| Creators | Mello, Bruno Luan Soares Paula de |
| Contributors | Polikarpov, Igor |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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