A Angiotensina II (Ang II), principal peptídeo efetor do Sistema Renina Angiotensina (SRA), tem sido relatada como importante mediador de processos inflamatórios. Considera-se de extrema relevância detectar esse sistema e compreender a modulação da Ang II nas células da papila apical (CPA) considerando que esta população celular é a chave no sucesso na revascularização pulpar. Vale também considerar que a infecção do sistema de canais radiculares pode alterar as funções destas células. Sendo assim, o presente trabalho in vitro teve como objetivo elucidar o papel do lipopolissacarídeo (LPS) nas células da papila apical, detectar os componentes do Sistema Renina Angiotensina (SRA) e compreender a modulação da Ang II nas CPA. Para vencer o desafio científico, culturas de células da papila foram estabelecidas e caracterizadas fenotipicamente por citometria de fluxo e funcionalmente por Vermelho de Alizarina. Quando estimuladas por LPS, foi feita análise da citotoxicidade por MTT e produção de citocinas e Osteoprotegerina (OPG) por ELISA. Em seguida, a detecção da expressão gênica dos componentes do Sistema Renina Angiotensina foi realizada por Transcrição Reversa seguida de Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa (RT-qPCR) e do peptídeo Ang II por ELISA. As células foram estimuladas com LPS, a própria Ang II e um antagonista do receptor de Angiotensina II tipo 1 (AT1) e avaliadas quanto à citotoxicidade por ensaio de MTT, capacidade de formação de nódulos mineralizados por Vermelho de Alizarina e produção de citocinas inflamatórias e OPG por ELISA. Os resultados demonstraram que culturas de CPA expressaram níveis típicos de marcadores de células-tronco mesenquimais CD146, CD24 e STR0-1 e formaram nódulos mineralizados com o meio de diferenciação. O estímulo com LPS a 0,1; 1 e 10?g/mL no decorrer de 1, 3, 5, 7 e 14 dias não afetou a viabilidade das CPA. As células estimuladas com LPS apresentaram níveis maiores da quimiocina MCP-1/ CCL-2 a 1?g/mL em uma e 24 horas e a expressão de OPG diminui na presença de LPS a 0,1 e 10?g/mL. Na concentração de 1?g/mL, foi detectada a expressão gênica de Angiotensinogênio, Renina, Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) e AT1. Houve maior expressão de ECA no período experimental de 1 hora com LPS e em 24 horas, apenas AT1 e ECA continuaram presentes. Sendo a produção da proteína soberana, Ang II foi encontrada nas células pelo ELISA. Os ensaios funcionais demonstraram que a Ang II aumentou a proliferação celular em 24, 48 e 72 horas. Em 24 horas, a presença do peptídeo efetor do SRA aumentou a produção da quimiociona MCP-1/ CCL-2 e do ligante do ativador do receptor do fator nuclear- ?B (RANKL). Concluímos que o LPS foi capaz de alterar funcionalmente as CPA, que o Sistema Renina Angiotensina está presente e a Ang II tem capacidade de modulação pró-inflamatória, proliferativa e de reabsorção óssea nesta população celular. / Angiotensin II (Ang II), the main effector peptide of the Renin Angiotensin System (SRA), has been reported as an important mediator of inflammatory processes. It is considered of extreme relevance to detect this system and understand the modulation of Ang II in the apical papilla cells (CPA) considering that this cellular population is the key in the success in pulpar revascularization. It is also worth noting that infection of the root canal system can alter the function of these cells. The aim of the present work was to elucidate the role of lipopolysaccharide (LPS) in the apical papilla cells, to detect the components of the Renin Angiotensin System (SRA) and to understand the modulation of Ang II in the CPA. To overcome the scientific challenge, cultures of papilla cells were established and characterized phenotypically by flow cytometry and functionally by Alizarin Red. When stimulated by LPS, cytotoxicity by MTT and cytokine and Osteoprotegerin (OPG) were analyzed by ELISA. Next, the detection of the gene expression of the components of the Renin Angiotensin System was performed by Reverse Transcription followed by quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR) and the Ang II peptide by ELISA. The cells were stimulated with LPS, Ang II itself and an Angiotensin II receptor antagonist type 1 (AT1) and evaluated for cytotoxicity by MTT assay, alizarin red mineralized nodule formation capacity, and production of inflammatory cytokines and OPG by ELISA. The results demonstrated that CPA cultures expressed typical levels of CD146, CD24 and STR0-1 mesenchymal stem cell markers and formed mineralized nodules with the differentiation medium. The stimulus with LPS at 0.1; 1 and 10?g/mL in the period of 1, 3, 5, 7 and 14 days did not affect the viability of CPA. LPS-stimulated cells had higher levels of 1?g/mL chemokine MCP-1/CCL-2 at one and 24 hours and OPG expression decreased in the LPS presence at 0.1 and 10?g/mL. At the concentration of 1 ?g/mL, the gene expression of Angiotensinogen, Renin, Angiotensin Converting Enzyme (ECA) and AT1 was detected. There was greater expression of ACE in the experimental period of 1 hour with LPS and in 24 hours, only AT1 and ACE remained present. Being the protein production sovereign, Ang II was found in the cells by the ELISA. Functional assays demonstrated that Ang II increased cell proliferation at 24, 48 and 72 hours. In 24 hours, the presence of the effector peptide of SRA increased the production of the chemokine MCP-1/CCL-2 and the activator of the nuclear factor receptor-KB (RANKL). We conclude that LPS was able to functionally alter CPA, that the Renin Angiotensin System is present and Ang II has the capacity for pro-inflammatory, proliferative and bone resorption modulation in this cell population.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-13032019-110419 |
| Date | 03 August 2018 |
| Creators | Pizzatto, Laís Nicolay |
| Contributors | Santos, Carlos Ferreira dos, Sipert, Carla Renata |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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