Os tumores embrionários do Sistema Nervoso Central (SNC) são os mais comuns em crianças de zero a quatro anos e a principal causa de mortalidade infantil. O tratamento convencional desses tumores malignos resulta em diversas sequelas que afetam significativamente a qualidade de vida dos sobreviventes. Diferentes estudos têm demonstrado que a ativação de genes tipicamente expressos em células-tronco, como o fator de pluripotência OCT4A, confere características mais primitivas e agressivas às células tumorais, frequentemente associadas ao prognóstico clínico desfavorável. Fundamentado na hipótese da existência das células-tronco tumorais (CTT) e sua contribuição na progressão tumoral, o presente estudo pré-clínico teve como objetivo identificar novos biomarcadores moleculares em tumores embrionários agressivos do SNC e avaliar novas abordagens terapêuticas capazes de destruir as CTT. A análise de proteomica e sequenciamento de microRNAs (miRNAs) presentes em microvesículas (MVs) derivadas de quatro linhagens celulares de meduloblastoma (DAOY, CHLA-01-MED, D283-MED e USP13-MED) identificou 464 proteínas e 10 miRNAs comumente expressos nas células tumorais com superexpressão de OCT4A. O estudo global de interação dessas proteínas e miRNAs exclusivamente expressas nas MVs derivadas das células tumorais com maior agressivas revelaram alteração em vias de sinalização como ERK, PI3K/AKT/mTOR, EGF/EGFR, e principalmente vias envolvidas com a auto renovação de células-tronco embrionárias (CTE). Dentre os fatores encontrados expressos nas MVs derivadas de células com superexpressão de OCT4A, quatro proteínas (UBE2M, HNRNPCL2, HNRNPCL3, HNRNPCL4) e cinco miRNAs (miR-4449, miR-500b, miR-3648, miR-1291, miR-3607) não apresentam relatos de expressão em tecidos normais, plasma ou soro sanguíneo. O miR-367, importante para a manutenção do estado pluripotente em CTE, também apresentou aumento dos níveis de expressão nas MVs derivadas de linhagens celulares de tumores embrionários do SNC com superexpressão de OCT4A. A inibição do miR-367 diminuiu significativamente a proliferação e invasão celular, a atividade clonogênica e a capacidade de gerar neuroesferas em todas as linhagens celulares de tumores embrionários do SNC. Em modelo pré-clínico de camundongos Balb/C Nude submetido ao xenoenxerto de tumores embrionários com superexpressão de OCT4A, foi demostrado que injeções seriadas do miR-367 inhibitor diretamente no líquido cefaloraquidiano foram capazes de inibir a progressão tumoral e aumentar significativamente a sobrevida in vivo. Neste mesmo estudo, foi comprovado que o SUZ12, componente do complexo PRC2 envolvido com o silenciamento epigenético de fatores de pluripotência, incluindo o gene POU5F1 que codifica o OCT4A, é alvo direto do miR-367. Por fim, visto que o vírus ZIKA (ZIKV) infecta preferencialmente células progenitoras neurais (NPCs), enquanto neurônios não são susceptíveis a infecção, inibindo a proliferação das células alvo, como também induzindo a diferenciação prematura e morte por apoptose, o efeito oncolítico do ZIKV também foi avaliado em tumores embrionários do SNC cujas células tumorais apresentam propriedades de células-tronco. A ZIKV infectou seletivamente e causou morte celular nas células tumorais de origem neural, porém o mesmo não foi observado nas células oriundas de tumor humanos mais comuns como tumor próstata, colorretal e mama. Em ensaio de cultura 3D, o ZIKV foi capaz de destruir as esferas de tumores embrionários do SNC com mais eficiência quando comparadas com neuroesferas normais formadas a partir de NPCs. Em ensaio in vivo, uma única injeção intracerebroventricular contendo mil partículas virais do ZIKV brasileiro foi capaz de aumentar significativamente a sobrevida de camundongos com tumores embrionários de origem humana, diminuir o tamanho do tumor, os sítios metastáticos, e apresentar remissão completa do tumor em vários animais. Adicionalmente, células tumorais com fenótipo molecular similar às NPCs e com ativação anormal da via de sinalização Wnt apresentaram maior suscetibilidade aos efeitos oncolíticos do ZIKV. Portanto, ao realizar a modulação da via Wnt, foi observado uma alteração significativa na infecção e morte celular causada pelo ZIKV. Deste modo, podemos concluir que diversas proteínas e miRNAs foram encontradas presentes exclusivamente em MVs derivadas de células tumorais com superexpressão de OCT4A e poderiam ser utilizadas como biomarcadores de agressividade em meduloblastoma. Adicionalmente, os ensaios in vitro e in vivo evidenciaram o miR-367, envolvido na regulação da auto renovação de CTE, como oncomiR e possível alvo terapêutico no tratamento de tumores embrionários do SNC. Além disso, o ZIKV demostrou potente e seletivo efeito oncolítico nas células tumorais do SNC com caráter progenitor e apresentou níveis de infecção mais proeminente nas células com alta expressão basal de Wnt/β -catenina. Portanto, os resultados pré-clínicos encontrados no presente estudo evidenciam novos biomarcadores de células tumorais agressivas com perfil de células-tronco, que podem ser explorados em futuras pesquisas translacionais de refinamento do diagnóstico clínico, estratificação de pacientes, detecção precoce de recidiva tumoral, além de revelar novas abordagens terapêuticas direcionadas às CTTs, beneficiando os pacientes afetados com tumores embrionários do SNC cujas terapias convencionais não são efetivas / Embryonal tumors of central nervous system (CNS) are the most fatal pediatric tumors occurring in young children. Treatment of these aggressive CNS tumors may also result in serious long-term sequelae, affecting the patient\'s quality of life. Several studies have demonstrated that activation of genes encoding proteins typically expressed in stem cells, such as the pluripotency factor OCT4A, confers more primitive and aggressive features to tumor cells. These stem-like features in cancer cells are often associated with unfavorable clinical prognosis. The aim of this preclinical study was to identify new molecular markers of aggressive embryonal CNS tumor cells and evaluate new therapeutic approaches capable of killing these stem-like tumor cells of the CNS. The rationale of this study considered the existence of the so called cancer stem cells (CSC) and their contribution to tumor progression. Proteome analysis and miRNA sequencing of microvesicles (MVs) derived from four distinct medulloblastoma cell lines (DAOY, CHLA-01-MED, D283-MED, and USP13-MED) identified a common set of 464 proteins and 10 microRNAs associated with aggressive OCT4A-overexpressing tumor cells. The interactome mapping of these exclusive proteins and miRNAs revealed ERK, PI3K/AKT/mTOR, EGF/EGFR, and embryonic stem cell (ESC) self-renewal as the main oncogenic signaling pathways altered in these aggressive medulloblastoma cells. Of these MV cargos, four proteins (UBE2M, HNRNPCL2, HNRNPCL3, HNRNPCL4) and five miRNAs (miR-4449, miR-500b, miR-3648, miR-1291, miR-3607) have not been previously reported in MVs from normal tissues. The miR-367 was another new ESC-related miRNA found up-regulated in embryonal CNS tumor cells overexpressing OCT4A. Inhibition of miR-367 in these cells significantly reduced their proliferative and invasive behavior, clonogenic activity, and tumorsphere generation capability. Therapeutic targeting of miR-367 in vivo, through direct injections of a specific inhibitor in the cerebrospinal fluid (CSF) of Balb/C Nude mice bearing OCT4A-overexpressing tumor xenografts, inhibited tumor development and improved overall survival. miR-367 was also shown to target SUZ12, one of the core components of the PRC2 complex known to be involved in epigenetic silencing of pluripotency-related genes, including POU5F1 encoding OCT4A. Finally, considering that the Zika virus (ZIKV) prominently infects and kills neural stem and progenitor cells (NPCs), we also tested whether ZIKV would have the same effects in CNS embryonal tumors, given that these tumors are originated from NPC aberrations and are comprised by cells with neural stem cell-like features. When evaluating the oncolytic properties of Brazilian ZIKV strain against human breast, prostate, colorectal and embryonal CNS tumor cell lines, a selective infection of CNS tumor cells, followed by a massive tumor cell death, was verified. Notably, ZIKV was more efficient in destroying embryonal CNS tumorspheres than normal stem cell neurospheres. A single intracerebroventricular injection of ZIKV in BALB/c nude mice bearing orthotopic human embryonal CNS tumor xenografts resulted in significantly longer survival, decreased tumor burden, fewer metastasis and complete remission in some animals. Tumor cells closely resembling neural stem cells at the molecular level and with activated Wnt signaling were more susceptible to ZIKV oncolytic effects. Furthermore, modulation of Wnt signaling pathway significantly affected ZIKV-induced tumor cell death and viral shedding. In conclusion, several proteins and miRNA were identified exclusively in MVs from OCT4A-overexpressing tumor cells, which might serve as biomarkers of aggressive stem-like medulloblastoma cells. The miR-367 involved in ESC self-renewal displayed properties typical of oncomiRs as indicated by in vitro and in vivo assays, supporting its eligibility as a therapeutic target in embryonal CNS tumor cells. Also, ZIKV displayed potent and selective oncolytic effects toward human embryonal CNS tumor cells, at low infection rates. These effects were more prominent in tumors generated by neural stem-like cancer cells with high Wnt/β-catenin basal activity. Altogether, these preclinical findings open opportunities of future translational studies to evaluate new putative biomarkers of aggressive stem-like tumor cells in refining diagnosis, patient stratification, and early detection of relapsed disease, while also revealing novel therapeutic approaches targeting these stem-like tumor cells that could benefit patients affected by CNS tumors lacking effective treatment
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-07052019-103413 |
| Date | 12 February 2019 |
| Creators | Dávila, Carolini Kaid |
| Contributors | Okamoto, Oswaldo Keith |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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