Die Speicheldrüsen der Schmeißfliege Calliphora vicina produzieren bei Stimulierung mit dem Neurohormon Serotonin (5-Hydroxytryptamine, 5-HT) einen KCl-reichen Primärspeichel. Der transepitheliale K+-Transport wird durch eine apikal lokalisierte vakuoläre H+-ATPase (V-ATPase) energetisiert. Stimulierung der Speicheldrüsen mit 5-HT aktiviert die apikale V-ATPase, die Protonen aus der Zelle in das Drüsenlumen transportiert. Trotz des auswärts gerichteten Protonentransportes führt die 5-HT-Stimulierung kurioserweise zu einer intrazellulären Ansäuerung. Die Ursachen dieser 5-HT-induzierten Ansäuerung waren unzureichend untersucht. Deshalb war das Ziel dieser Arbeit die Identifikation aller Transporter, die an der intrazellulären pH-(pHi)-Regulation in unstimulierten Speicheldrüsen von Calliphora vicina beteiligt sind und an der Entstehung und Regulation der 5-HT-induzierten pHi-Änderungen mitwirken. Von besonderem Interesse war hierbei die funktionelle Mitwirkung der V-ATPase, deren Beteiligung an der pHi-Regulation in tierischen Zellen bisher wenig untersucht war.
Wesentliche Ergebnisse dieser Arbeit waren:
• Messungen des pHi-Wertes in der unstimulierten Drüse zeigten, dass vor allem
die V-ATPase und mindestens ein Na+-abhängiger HCO3--Transporter an der Aufrechterhaltung des Ruhe-pHi beteiligt sind.
• Zur Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellulären Ansäuerung
(NH4Cl-Vorpuls) tragen ebenfalls im Wesentlichen die V-ATPase und mindestens
ein Na+-abhängiger HCO3--Transporter bei. Der Na+/H+-Antiporter hat in der
unstimulierten Drüse keinen messbaren Einfluss auf den Ruhe-pHi.
• Die Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellulären Alkalisierung
(Na-acetat-Vorpuls) ist Cl--abhängig, aber auch unter extremen Bedingungen
waren die Zellen noch in der Lage sich vollständig von einer intrazellullären
Alkalisierung zu erholen. Einen entscheidenden Anteil daran hat offenbar die hohe intrazelluläre Puerkapazität.
• Ein Na+-abhängiger Glutamat-Transporter ist per se kein pHi-regulierender
Transporter, seine Aktivität hat jedoch Einfluss auf den Ruhe-pHi in der
unstimulierten Speicheldrüse von Calliphora vicina.
• 10 nM 5-HT induzieren in den Calliphora Speicheldrüsen eine intrazelluläre
Ansäuerung. An dieser Ansäuerung ist der Na+/H+-Antiporter entscheidend
beteiligt. Auch eine klare Cl--Abhängigkeit der 5-HT-induzierten Ansäuerung konnte beobachtet werden. Wahrscheinlich ist eine gekoppelte Aktivität von Na+/H+-Antiporter und Cl-/HCO3--Antiporter.
• Messungen mit einem O2-empndlichen Fluoreszenzfarbstoff zeigten, dass Stimulierung der Speicheldrüsen mit 5-HT die Zellatmung aktivierte. Der cAMP- und der IP3/Ca2+-Weg tragen auf komplexe Weise zu der 5-HT-induzierten Aktivierung der Zellatmung und damit auch zu den 5-HT-induzierten pHi-Änderungen bei.
• Mit molekularbiologischen Untersuchungen ist es gelungen den Na+-abhängigen
Glutamat-Transporter, den Na+/H+-Antiporter, die Carboanhydrase und die
Untereinheit C der V-ATPase in den Calliphora Speicheldrüsen direkt
nachzuweisen. Zudem konnte erstmals der direkte Nachweis für die Expression
eines nH+/K+-Antiporters in den Speicheldrüsen von Calliphora vicina erbracht
werden.
Diese Arbeit trug ganz wesentlich zum Verständnis der pHi-Regulation in der
unstimulierten und stimulierten Speicheldrüse von Calliphora vicina bei. Mechanismen die zur Aufrechterhaltung und Wiederherstellung des Ruhe-pHi nach einer intrazellulären Ansäuerung bzw. Alkalisierung beitragen, konnten mit pHi-Messungen und auch molekularbiologisch nachgewiesen werden. Die Mechanismen, welche die 5-HT-induzierte intrazelluläre Ansäuerung verursachen, konnten ebenfalls aufgeklärt werden. Zudem wurde an den Calliphora Speicheldrüsen eine neue optische Methode zur Messung des O2-Verbrauchs in tierischen Geweben etabliert. / The tubular salivary glands of the blowfly Calliphora vicina consist of a single layer of epithelial cells. Stimulation with the neurohormone serotonin (5-hydroxytryptamine,5-HT) induces the secretion of a KCl-rich primary saliva. Transepithelial K+-transport is energized by a vacuolar-type H+-ATPase (V-ATPase) which is located in the apical membrane. 5-HT stimulates the apical V-ATPase which transports protons out of the cells into the lumen of the glands. Despite this outward directed proton transport, 5-HT stimulation leads to an intracellular acidication. The causes of this intracellular acidication were poorly understood. Therefore the aim of this thesis was the identication of all pHi regulating transporters which are involved in pHi regulation
in the unstimulated salivary glands of Calliphora vicina and which contribute to the 5-HT-induced pHi changes. Of special interest was the functional role of the V-ATPase,whose contribution to pHi regulation in animal cells is, as yet, not well studied.
Key results were:
• pHi measurements in unstimulated glands showed that mainly the V-ATPase and
at least one Na+-dependent HCO3--transporter are involved in maintenance of
resting pHi.
• V-ATPase and at least one Na+-dependent HCO3--transporter are also necessary
for the recovery from an intracellular acidication (NH4Cl prepulse).
• Recovery from an intracellular alkali load (Na-acetate prepulse) is partially
Cl--dependent.
• A Na+ dependent gluatamate-transporter is present in Calliphora salivary glands and its activity aects the resting pHi.
• 10 nM 5-HT induce an intracellular acidication. This acidication is
Na+-dependent, EIPA-sensitive and also Cl--dependent. No DIDS-sensitivity
was observed. A coupled activity of a Na+/H+-antiporter and a Cl-/HCO3-
-antiporter was suggested.
• Using O2-sensitive fluorescent microbeads I could show that 5-HT stimulation
of the Calliphora salivary glands activates cellular respiration. The cAMP and Ca2+-signalling pathways contribute in a complex manner to the 5-HT-induced activation of cellular respiration and consequently, also to the 5-HT-induced
intracellular acidication.
• The expression of a Na+ dependent glutamate-transporter, a Na+/H+-antiporter,
a carbonic anhydrase, subunit C of the V-ATPase and a nH+/K+-antiporter were
determined on mRNA level by RT-PCR.
This thesis contributes signicantly to the understanding of pHi regulation in
unstimulated and stimulated salivary glands of Calliphora vicina. Mechanisms which contribute to the maintenance and recovery of resting pHi were identied by
using pHi measurements and molecular biological techniques. Mechanisms which
are responsible for the 5-HT-induced intracellular acidication were also clarified.
Furthermore a new optical method for measuring O2 consumption in animals cells
was established by using the Calliphora salivary glands as a model.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:Potsdam/oai:kobv.de-opus-ubp:2687 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Schewe, Bettina |
| Publisher | Universität Potsdam, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät. Institut für Biochemie und Biologie |
| Source Sets | Potsdam University |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | Text.Thesis.Doctoral |
| Format | application/pdf |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.0/de/ |
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