A trealase solúvel foi purificada a partir do intestino de S. frugiperda. Os pKas dos grupos catalíticos determinados por inativação química são similares aos pKas determinados por analise cinética, indicando que a enzima tem um grupo carboxila que atua como um nucleófilo e um grupo guanidina que atua como doador de prótons. Dietil pirocarbonato não afeta a enzima, exceto na presença de MalfaGlu (inibidor competitivo). A modificação com DPC diminui a atividade enzimática da trealase e muda o valor do pKa do resíduo de Arg, indicando que o resíduo de His modula o pKa do doador de prótons. Trealase tem dois subsítios para a ligação de glicose e baseado na proteção por MalfaGlu durante a modificação química é possível inferir que o subsítio que liga MalfaGlu contém o grupo carboxila, e o outro subsítio possui o resíduo de Arg que atua como grupo catalítico e o resíduo de His. Usando diferentes estratégias nós obtivemos uma seqüência parcial do cDNA que aparentemente codifica para trealase (denominada trealase 1) e clonamos e expressamos a enzima denominada trealase 2. A trealase 2 foi expressa em Bl21 DE3 e purificada, sendo que suas propriedades são similares a enzima solúvel. O cDNA da trealase 1 provavelmente codifica para a trealase de membrana encontrada no intestino de S. frugiperda. A trealase 2 tem 587 aminoácidos, um pepitideo sinal com 23 aminoácidos e seis possíveis sítios para glicosilação. A enzima apresenta alta identidade e similaridade (61% e 76%, respectivamente) com a trealase digestiva de B. mori. Foi determinada a atividade de trealase presente na carcaça, Túbulos de Malpighi, corpo gorduroso, intestino e hemolinfa de Tenebrio molitor, Musca domestica, Spodoptera frugiperda e Diatraea saccharalis na presença e na ausência de ß-glicosideos tóxicos produzidos por plantas. Os glicosídeos usados foram amigdalina, prunasina, florizina e o aglicone mandelonitrila. E a atividade das trealases de T. molitor e S. frugiperda foi determinada também na presença de esculina. Prunasina é o melhor inibidor das trealases de T. molitor, já para as trealases (ligadas a membrana) de D. saccharalis o melhor inibidor é florizina e esculina é o melhor inibidor das trealases de S. frugiperda. Nós alimentamos S. frugiperda com uma dieta contendo 0,1% de esculina e sua presença nós tecidos foi detectada por fluorescência. Esculina foi encontrada no corpo gorduroso, Túbulos de Malpighi e hemolinfa e não foi encontrada na carcaça. A maior quantidade de esculina foi registrada na hemolinfa (0,2 mM) e as larvas alimentadas com uma dieta contendo esculina são 40% menor que as larvas alimentadas numa dieta controle. A inibição das trealases pode ser um dos fatores que leva a diminuição de peso das larvas experimentais. As larvas de S. frugiperda criadas numa dieta com 0,1% de amigdalina apresenta em alguns tecidos um aumento na atividade especifica de trealase o que não é observado quando as larvas são alimentadas com uma dieta com 0,1% de esculina. O aumento na atividade especifica de trealase pode ser uma das razões pela qual o desenvolvimento de S. frugiperda não é afetado pela amigdalina presente na dieta. / A soluble trehalase was purified from Spodoptera frugiperda midgut. The pKas of the catalitical groups determined by chemical inactivation agrees with the ones determined by kinetical analysis, indicating that the enzyme has a carboxyl group that acts as a nucleophile and a guanidine group that is the proton donor. Diethyl pyrocarbonate (DPC) does not affect to the enzyme, except in the presence of MalphaGlu (a competitive inhibitor). DPC modification decreases trehalase activity and changes the pKa value of the catalytical Arg residue, indicating that pKa of the proton donor His residue modulates. Trehalase has two subsites for glucose binding and based on the protection by MalphaGlu against chemical modification it is possible to infer that the subsite that binds MalphaGlu contains the catalytic carboxyl, whereas the other has the catalytical Arg residue and the His residue. Using different strategies we succeeded in obtaining a partial sequence of a cDNA that apparently codes for trehalase (called trehalase 1) and in molecular cloning and expressing the enzyme named trehalase 2. Trehalase 2, expressed in Bl21 DE3 cells was purified and its properties are similar to the soluble enzyme. Trehalase 1 cDNA probably codes for a membrane-bound trehalase found in S. frugiperda midgut. Trehalase 2 has 587 amino acids, a signal peptide with 23 amino acids and six possible sites for glycosilation. The enzyme present higher identity and similarity (61% and 76%, respectively) to digestive trehalase of Bombyx mori. Trehalase from body wall, Malpighian tubules, fat body, midgut and haemolymph from Tenebrio molitor, Musca. domestica, Spodoptera frugiperda and Diatraea saccharalis were assayed with and without the presence of toxic glucosides produced by plants. The glucosides used were amygdalin, prunasin, phlorizin and the aglycone mandelonitrile. In addition, T. molitor and S. frugiperda trehalases were assayed with esculin. Prunasin is the best inhibitor in T. molitor and M. domestica, phlorizin in D. saccharalis (only membrane-bound activity) and esculin in S. frugiperda. We fed S. frugiperda with a diet containing 0.1 % esculin and followed its fate by fluorescence. Esculin is recovered from fat body, Malpighian tubules and haemolymph. No esculin was found in body wall. The majority of esculin was recovered in haemolymph (0.2 mM) and larvae fed on esculin-containing diet weigh 40 % less than control ones. Trehalase inhibition by esculin may account for at least part of the observed decrease in larval weight. S. frugiperda larvae reared in 0.1% amygdalin-containing diet present higher trehalase activities in several tissues than the larvae reared in 0.1% esculin-containing diet. Higher trehalase activity should be the reason why S. frugiperda development is affected by esculin, but is not impaired by amygdalin present in the diet.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-28092006-145250 |
| Date | 09 May 2006 |
| Creators | Maria Cicera Pereira da Silva |
| Contributors | Clelia Ferreira Terra, Iolanda Midea Cuccovia, Manuel Troyano Pueyo, Ivarne Luís dos Santos Tersariol, Carlos Eduardo Winter |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Biológicas (Bioquímica), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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