O diabetes mellitus tipo 1 (DM-1) e a esclerose múltipla (EM) são doenças auto-imunes órgão-específicas, inflamatórias, mediadas por células T e B auto-reativas e caracterizadas pela destruição seletiva de células b pancreáticas produtoras de insulina e do sistema nervoso central, respectivamente. Acredita-se que a desregulação da expressão de genes reguladores da maquinaria apoptótica possa contribuir para o desenvolvimento da auto-imunidade, visto que algumas dessas moléculas participam nos processos de tolerância central e periférica de linfócitos auto-reativos. O objetivo deste projeto foi analisar a expressão de moléculas reguladoras das vias intrínseca, extrínseca e da Família de proteínas inibidoras da apoptose (IAP) em 33 indivíduos saudáveis, 15 pacientes com DM-1 e 18 com EM submetidos à terapia de imunossupressão em altas doses seguida do transplante autólogo de células-tronco hematopoéticas (IAD/TACTH). As células mononucleares (CMN) foram isoladas do sangue periférico dos controles e de pacientes nos períodos pré-mobilização (pré-mob), pré-condicionamento (pré-cond), D+180, D+360, D+540 e D+720 pós-transplante. As CMN foram utilizadas para extração de RNA, síntese de cDNA, quantificação da expressão por PCR em tempo real dos genes a1, bcl-2, bcl-w, bcl-xL, mcl-1, bad, bak, bax, bid, bik, bim, bok, noxa, fas, fasL, c-FLIPL, cIAP-1 e cIAP-2 e protéica de Bcl-2, Bcl-xL, Bak, Bim e c-FLIPL por western-blotting. Os resultados de expressão gênica foram representados por unidades relativas de expressão em medianas nas diferentes amostras. Os pacientes com DM-1 apresentaram diminuição da expressão dos genes anti-apoptóticos bcl-2 (mediana: 0,98; p=0,04), bcl-w (0,08; p=0,04), mcl-1 (1254; p=0,03) e cIAP-1 (1,24; p=0,003) nas CMN dos pacientes no período pré-mob em relação aos indivíduos saudáveis (medianas: bcl-2: 7,58; bcl-w: 0,52; mcl-1: 1659; cIAP-1: 14,5), enquanto a expressão de cIAP-2 (60,8; p=0,0005) estava aumentada em relação aos controles (23,3). Foi observada redução significativa na expressão dos genes pró-apoptóticos bad (0,002; p<0,0001), bax (0,01; p=0,002) e fasL (1,66; p=0,001) no período pré-mob comparada aos controles sadios (bad: 0,23; bax: 2,79; fasL: 3,56). Os níveis de RNAm de bid (0,10; p=0,001) e bok (0,72; p=0,006) estavam elevados no pré-mob em relação ao grupo controle (bid: 0,004; bok: 0,31). As moléculas bcl-2, bcl-w, bcl-xL, mcl-1, bad, bax, bok, fasL e cIAP-1 atingiram níveis de RNAm similares aos controles após o TACTH. Foi verificado que a expressão de bcl-w, cIAP-1 e noxa estava maior nos pacientes com DM-1 em remissão quando comparados àqueles em recaída. A diminuição da expressão de a1, bcl-2 e bcl-w e o aumento de fas e noxa correlacionaram-se às porcentagens de hemoglobina glicosilada, concentração de auto-anticorpos GAD65, e aos níveis séricos de peptídeo-C após o transplante. Os pacientes com EM mostraram uma expressão reduzida dos genes anti-apoptóticos bcl-w (0,11; p=0,02) e cIAP-1 (1,87; p=0,04) no pré-mob comparada aos valores dos controles (bcl-w: 0,27; cIAP-1: 7,75) e maior expressão dos genes a1 (90,8; p=0,001) e cIAP-2 (58,8; p=0,009) em relação aos controles (a1: 12,7; cIAP-2: 22,3). As moléculas pró-apoptóticas bad (0,007; p=0,01) e bax (0,0007; p=0,004) mostraram menor expressão nas CMN no período pré-mob do que nos controles (bad: 0,27; bax: 1,24). Os genes bid (20,7; p=0,004), bik (0,84; p=0,02) e bok (1,77; p=0,0001) possuíam maior expressão no período pré-mob em relação aos indivíduos sadios (bid: 2,64; bik: 0,33; bok: 0,26). Não foram observadas diferenças significativas na expressão das moléculas da via extrínseca da apoptose nos pacientes com EM (p>0,05) nos períodos avaliados. Os valores de expressão de bcl-w, bak, bax, bik, bok e cIAP-1 atingiram níveis semelhantes aos controles após o transplante. A expressão dos genes bcl-2, cIAP-1, bad e bax estava maior nos pacientes em remissão da EM quando comparados àqueles em progressão neurológica. O aumento da expressão dos genes pró-apoptóticos bax, bak e bimEL correlacionou-se inversamente aos valores de EDSS dos pacientes com EM após o TACTH. Os resultados de expressão protéica foram equivalentes aos de expressão gênica nas duas doenças, com exceção dos dados das proteínas Bcl-2 e Bim. Em conjunto, os resultados demonstraram a desregulação da expressão de várias moléculas anti- e pró-apoptóticas nas CMN dos pacientes com DM-1 e EM. Esses achados sugerem a associação de alterações nos processos de apoptose celular com o surgimento e persistência de células auto-reativas no DM-1 e EM. Os dados indicam que essas alterações, principalmente a diminuição da expressão de moléculas pró-apoptóticas, como bak e bax, possam contribuir para a patogênese do DM-1 e EM. Além disso, a terapia de IAD/TACTH foi capaz de modular a expressão da maioria dos genes anormalmente expressos nas CMN dos pacientes com DM-1 e EM, já que esses atingiram níveis de expressão similares ao grupo controle após o transplante. Esta normalização da expressão de vários genes analisados correlacionou-se com a remissão clínica da doença na maioria dos pacientes / Type 1 diabetes mellitus (T1DM) and multiple sclerosis (MS) are inflammatory, organ-specific autoimmune diseases characterized by selective destruction of insulin-producing pancreatic -cells and central nervous system, respectively, by autoreactive B and T cells. Deregulation of apoptotic machinery is supposed to contribute to self-tolerance breakdown and autoimmune diseases pathogenesis, since apoptotic molecules have an important role in B and T lymphocytes central and peripheral tolerance mechanisms. The aim of this study was to evaluate the expression of pro and anti-apoptotic molecules from intrinsic and extrinsic apoptotic pathways and IAP Family members in 33 healthy individuals, 15 T1DM and 18 MS patients submitted to high-dose immunossupression therapy followed by autologous hematopoietic stem cell transplantation (HDI/AHSCT). Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from controls and patients at pre-mobilization (pre-mob), pre-conditioning (pre-cond), D+180, D+360, D+540 and D+720 post-transplantation. PBMC were used for RNA extraction, cDNA synthesis, gene quantification of a1, bcl-2, bcl-w, bcl-xL, bad, bak, bax, bid, bik, bimEL, bok, noxa, fas, fasL, c-FLIPL, cIAP-1 and cIAP-2 by Real Time PCR and Bcl-2, Bcl-xL, Bak, BimEL and c-FLIPL proteins detection by western-blotting. Results are expressed as median of relative expression units. Results from T1DM patients indicated that antiapoptotic molecules bcl-2 (median: 0,98; p=0,04), bcl-w (0,08; p=0,04), mcl-1 (1254; p=0,03) and cIAP-1 (1,24; p=0,003) were downregulated at pre-mob compared with healthy controls (medians bcl-2: 7,58; bcl-w: 0,52; mcl-1: 1659; cIAP-1: 14,5), while cIAP-2 (60,8; p=0,0005) gene expression was upregulated compared to healthy controls (23,3). We observed a significant decrease in proapoptotic bad (0,002; p<0,0001), bax (0,01; p=0,002) and fasL (1,66; p=0,001) genes expression in patients PBMC at pre-mob period compared to healthy subjects (bad: 0,23; bax: 2,79; fasL: 3,56). mRNA levels of bid (0.10; p=0.001) and bok (0.72; p=0.006) were elevated at pre-mob period when compared to control group (bid: 0.004; bok: 0.31). The bcl-2, bcl-w, bcl-xL, mcl-1, bad, bak, bax, bok, fasL and cIAP-1 mRNA levels reached controls levels after HDI/AHSCT. We observed that bcl-w, cIAP-1 and noxa gene expression were increased in T1DM patients in remission when compared to relapsed patients. The decreased antiapoptotic gene expression and increased in proapoptotic molecules correlated with decreased glicosilated hemoglobin percentages (Hb A1C) and anti-GAD65 antibodies and increased peptide-C levels. Results from MS patients showed decreased bcl-w (0,11; p=0,02) and cIAP-1 gene expression (1,87; p=0,04) in patients PBMC at pre-mob period compared to healthy controls (bcl-w: 0,27; cIAP-1: 7,75) and increased expression of a1 (90,8; p=0,001) and cIAP-2 (58,8; p=0,009) compared to controls (a1: 12,7; cIAP-2: 22,3). Proapoptotic molecules bad (0.007; p=0.01) and bax (0.0007; p=0.004) showed decreased gene expression at pre-mob compared to control group (bad: 0.27; bax: 1.24). bid (20.7; p=0.004), bik (0.84; p=0.01) and bok genes (1.77; p=0.0001) showed increased expression at pre-mob compared to healthy controls (bid: 2.64; bik: 0.33; bok: 0.26). Significant differences were not observed in the expression of the extrinsic pathway genes in pre-mob and healthy controls samples (p>0.05). bcl-w, bak, bax, bik, bok and cIAP-1 expression values reached healthy control values after transplantation. We observed that bcl-2, cIAP-1, bad and bax gene expression was increased in MS patients in disease remission when compared to patients with neurologic progression. Significant correlation of increased proapoptotic genes expression with decreased EDSS values in MS patients after HDI/AHSCT was observed. Results of protein quantification of apoptotic molecules in PBMC of T1DM and MS patients were similar to the gene expression results of these molecules, except for Bcl-2 and Bim proteins. Taken together, these data indicate a deregulated expression of anti- and proapoptotic genes in T1DM and MS patients PBMC. These data suggest an association of deregulated apoptosis with emergence and maintenance of autoreactive lymphocytes in analyzed patients. Based on these results, we suggest that this altered gene expression profile, mainly the decreased proapoptotic genes expression, as bak and bax, may contribute to T1DM and MS pathogenesis. Furthermore, we showed that the HDI/AHSCT therapy was able to modulate and normalize the expression of most genes abnormally expressed in T1DM and MS patients at pre-transplant period. Many analyzed genes achieved expression levels similar to healthy controls. The normalization of the expression of many evaluated genes correlated to disease remission in the majority of the patients.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-24112008-090815 |
| Date | 17 October 2008 |
| Creators | Gislane Lelis Vilela de Oliveira |
| Contributors | Fabíola Attié de Castro, Marcelo Dias Baruffi, Paulo Louzada Júnior |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Biociências Aplicadas à Farmácia, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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