Les données de séquençage des génomes ont révélé une nouvelle famille de protéines UPF0079, comprenant des protéines de fonction inconnue qui sont exclusivement et largement présentes chez les bactéries et qui possèdent un motif A de Walker dans leur séquence. La caractérisation biochimique et l'élucidation du rôle physiologique de cette famille contribueront à élargir nos connaissances en biologie fondamentale, et sont également un préalable vers le développement de nouveaux composés antimicrobiens. Notre étude sur YdiB, un archétype de cette famille chez Bacillus subtilis a révélé à la fois l‟autophosphorylation de YdiB et son activité de protéine kinase. L‟activité kinase de double spécificité Ser/ Thr et Tyr de YdiB semble nécessiter son oligomérisation et semble être stimulée par des molécules basiques telles que des polyamines naturelles ou la poly-L-lysine. Les 10 résidus les plus conservés chez cette famille ont été étudiés afin de mieux comprendre le mécanisme moléculaire de YdiB. Concernant la caractérisation fonctionnelle de la phosphorylation liée à YdiB, l‟étude de l‟opéron ydiA-B-C-D-E de B. subtilis nous a permis de montrer que YdiB et YdiC fonctionnent comme un couple de protéine kinase/phosphatase de deux protéines substrats dont les fonctions seraient liées aux ribosomes, YdiD et YdiE. Une co-localisation partielle entre YdiB et les ribosomes a été observée. En outre, YdiB est capable de phosphoryler des protéines ribosomiques appartennant aux deux sous-unités 50S et 30S, ainsi que deux GTPases impliquées dans la biogénèse des ribosomes, EngA et EngB. Nous avons également démontré que EngA phosphorylée par YdiB est un substrat in vitro de la phosphatase YdiC. Enfin, basé sur le phosphoprotéome de Bacillus subtilis, des peptides mimant des sites de phosphorylation in vivo ont été utilisés. Certains entre eux sont phosphorylés in vitro par YdiB. Deux de ces peptides appartiennent à la superoxyde dismutase, SodA, dont l'activité in vitro et après purification est régulée positivement via la phosphorylation par YdiB. Nous avons ensuite constaté que les cellules de B. subtilis dépourvues du gène ydiB sont plus sensibles aux agents oxidants tels que le paraquat ou la norfloxacine. Nous proposons que, in vivo, YdiB fonctionne comme une protéine kinase impliquée dans l‟activité et/ou la stabilité des ribosomes dans des conditions physiologiques normales, et YdiB contribuerait à protéger les cellules contre les dommages du stress oxydatif. / Genome sequencing data has revealed genes encoding uncharacterized protein family UPF0079 which are exclusively found in bacteria; broadly distributed in this kingdom and possess an ATP-binding motif in their sequences. Biochemical characterization and physiological role elucidation of UPF0079 will undoubtedly increase our fundamental biology knowledge, and also remain a prerequisite towards the development of new antimicrobial compounds. Our investigation on YdiB, an archetype of this family in Bacillus subtilis revealed both autophosphorylating and protein phosphotransferase activities. The dual-specificity Ser/Thr and Tyr kinase activity of YdiB seems to require oligomerization is upregulated by basic molecule activators such as natural polyamines or poly-L-lysine. The 10 most conserved residues were studied to gain insights into molecular mechanism of the kinase YdiB. To characterize the function of phosphorylation events linked to YdiB, starting with the B. subtilis ydiA-B-C-D-E operon we showed that YdiB and YdiC function as cognate protein kinase/phosphatase towards two ribosome-related protein substrates YdiD and YdiE. Some co-localization between YdiB and ribosomes were observed. Furthermore, YdiB is capable of phosphorylating both ribosomal 50S and 30S subunits as well as two ribosome-binding GTPases EngA and EngB. We also demonstrated that phosphorylated EngA by YdiB is an in vitro substrate of the phosphatase YdiC. Finally, based on the phosphoproteome pf Bacillus subtilis, peptides mimicking the in vivo phosphorylation sites were used. Some of them were found to be phosphorylated in vitro by YdiB, including two peptides which belongs to the superoxide dismutase SodA. The activity of purified SodA was then shown to be upregulated via phosphorylation by YdiB. We furthermore found that B. subtilis cells lacking ydiB become more sensitive to oxidative stress-causing agents such as paraquat or norfloxacin. We propose that in vivo, YdiB functions as a protein kinase involved in ribosome function in normal condition; and in protecting cells from oxidative stress damage.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2012GRENV017 |
| Date | 23 May 2012 |
| Creators | Nguyen, Hien-Anh |
| Contributors | Grenoble, Jault, Jean-Michel |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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