Magíster en ciencias biológicas y médicas mención biología celular / El tejido adiposo cumple distintas funciones tales como protección mecánica, reserva
de energía, función endocrina, etc. Durante los últimos años se ha documentado su
uso como fuente abundante y accesible de células estromales multipotenciales para
medicina regenerativa. Actualmente, el protocolo estandarizado comprende el
procesamiento del tejido adiposo con una digestión enzimática (colagenasa) para
posteriormente rescatar la fracción vascular estromal (SVF). Ésta se siembra en una
matriz de plástico apta para cultivos celulares, obteniéndose un subgrupo de células
elongadas que comienzan a adherirse a la placa de cultivo (SVF-AC), permitiendo la
aparición de una población celular adherente denominada “células estromales
derivadas del tejido adiposo”. Diversos estudios han demostrado que éstas
mantienen su capacidad de diferenciación en múltiples tipos celulares (endo, meso y
ectodérmico), siendo candidatas adecuadas para muchas aplicaciones en medicina
regenerativa e ingeniería de tejidos. Sin embargo, una de las limitantes para la
aplicación clínica de estas células, es contar con una masa celular critica que permita
un adecuado tratamiento. Ante ello, surge la interrogante de cómo criopreservarlas,
manteniendo a su vez, la viabilidad y el potencial de diferenciación luego de un ciclo
de congelación. El uso de compuestos que tengan propiedades criopreservantes ha
mostrado ser un prerrequisito para el éxito de un proceso de congelación.
Idealmente, un medio para criopreservar SVF-AC debe tener una baja toxicidad y
lograr una alta viabilidad celular sin disminuir el potencial de diferenciación. En
nuestro laboratorio, luego de criopreservar SVF-AC utilizando dimetilsulfóxido
(DMSO) 10%, no logramos obtener tasas de viabilidad descritas en la literatura. Nuestra hipótesis es que una combinación de un medio basal (medio DMEM/F12 con
rojo fenol) suplementado con DMSO, trehalosa y albúmina humana puede mejorar
significativamente las tasas de recuperación celular post criopreservación, en
comparación con medios que utilizan sólo DMSO. En el presente trabajo, medimos la
tasa de viabilidad celular post criopreservación de SVF-AC obtenidas de 5 pacientes
utilizando medios definidos y libres de suero bovino: DMSO 10%; DMSO 10% +
Trehalosa 7,6%; DMSO 10% + Albúmina humana 10% y DMSO 10% + Trehalosa
7,6% + Albúmina humana 10%; mediante ensayo metabólico midiendo absorbancia
(MTT) e indeminidad de membranas cuantificado por citometría de flujo con ioduro
de propidio (PI). Los resultados obtenidos nos demuestran que no existen diferencias
estadísticamente significativas en las tasas de viabilidad de SVF-AC posterior a un
ciclo de criopreservación a diferentes niveles, desde el punto de vista metabólico con
el ensayo de MTT, y a nivel de estructura de membrana por marcación de PI por
citometría de flujo. Sin embargo, se observa una tendencia a mejorar la tasa de
recuperación de células vitales al agregar albúmina humana. Por otro lado no se
lograron obtener tasas de viabilidad tan altas como las reportadas por otros autores.
Se discuten las posibles causas y se proponen alternativas para estudiarlas.
En conclusión, podemos decir que no existe ninguna condición estudiada que sea
superior a las demás en cuanto a rendimiento. Es así como en respuesta a la
hipótesis de trabajo podemos afirmar que la criopreservación de las SVF-AC en un
medio que combine DMEM/F12 con DMSO 10% + Trehalosa 7,6% + Albúmina
humana 10% no logra una tasa de recuperación de células vitales significativamente
mayor que aquellas congeladas sólo con DMSO 10%. / Adipose tissue has different functions such as mechanical protection, energy reserve,
endocrine function, etc. In recent years has been documented it use as abundant and
accessible source of multipotent stromal cells for regenerative medicine. Currently, a
standardized protocol comprises processing adipose tissue with enzymatic digestion
(collagenase) and then rescue the stromal vascular fraction (SVF). This is sown in a
plastic matrix suitable for cell cultures to yield a subset of elongated cells to adhere to
the culture plate (SVF-AC), allowing the appearance of an adherent cell population
called "stromal cells derived from adipose tissue". Several studies have shown that
they maintain their ability to differentiate into multiple cell types (endo, meso and
ectodermal), being suitable candidates for many applications in regenerative
medicine and tissue engineering. However, one of the limitations for the clinical
application of these cells is to have a critical cell number to provide an adequate
treatment. In response, the question is how to cryopreservate them, while maintaining
the viability and differentiation potential after a freeze cycle. Use of compounds with
cryoprotective properties have shown to be a prerequisite for the success of a
freezing process. Ideally, a cryoprotectant for SVF-AC must have low toxicity and
achieve high cell viability without decreasing the differentiation potential. In our
laboratory, after SVF-AC cryopreservation using 10% dimethyl-sulfoxide (DMSO) it is
unable for us to obtain the viability rates reported in the literature. Our hypothesis is
that a combination of a basal medium (DMEM / F12 medium with phenol red)
supplemented with DMSO, trehalose and human albumin, can significantly improve
cell recovery rates after cryopreservation compared to using only DMSO. In this study, we measured the rate of cell viability after cryopreservation of SVF-AC
obtained from 5 patients using a defined and serum-free medium: 10% DMSO; 10%
DMSO + 7.6% Trehalose; 10% DMSO + 10% human albumin and 10% DMSO +
7.6% Trehalose + 10% human albumin; by measuring absorbance with a metabolic
assay (MTT) and membrane indemnity quantified by flow cytometry with propidium
iodide (PI). The results show us that there are no statistically significant differences in
rates of SVF-AC viability after a cryopreservation cycle at different levels, from a
metabolic point of view with the MTT assay, and membrane structure level with IP by
flow cytometry. However, a tendency is observed to improve the recovery rate of vital
cells by adding human albumin. On the other hand we could not get viability rates as
high as those reported by other authors. Possible causes are discussed and
proposed alternatives for study.
In conclusion, we can say that there were not a studied condition better than others in
terms of efficiency. Thus, in response to the working hypothesis we can say that the
cryopreservation of the SVF-AC in a medium that combines DMEM / F12 with 10%
DMSO + 7.6% Trehalose + 10% human albumin fails in obtaining a significantly
higher recovery rate of vital cells than those frozen with only 10% DMSO.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/170928 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Pereira Covarrubias, Nicolás Felipe |
| Contributors | Caviedes, Pablo, Universidad de Chile, Facultad de Medicina, Escuela de Postgrado |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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