Le Syndrome de l'X Fragile (FXS) est la forme héréditaire majoritaire dedéficience intellectuelle et la cause monogénique de l'autisme. Le FXS est causé par unemutation du gène Fragile X Mental Retardation 1 (Fmr1), qui entraîne son inactivationet l'absence d’expression de la protéine codée: Fragile X Mental Retardation Protein(FMRP). FMRP est une protéine de liaison à l’ARN, impliquée dans la régulation de lasynthèse protéiques à la synapse. Un rôle central est attribué au sous-type 5 desrécepteurs métabotropiques au glutamate du groupe I (mGluR5) dans laphysiopathologie du FXS. En effet, une réponse exagérée suite à l'activation de mGluR5pourrait expliquer le dysfonctionnement synaptique dans ce syndrôme. Bien que denombreux travaux aient mis l'accent sur la dérégulation de la synthèse des protéinessynaptiques comme une conséquence de cette signalisation accrue du mGluR5, il y aaussi un équilibre altéré dans l'association de mGluR5 avec les différentes isoformes desprotéines Homer, partenaires de densité post-synaptique (PSD) du mGluR5. Bien qu'uneabondante littérature décrit l'association mGluR5/Homer, les conséquences de laperturbation de cette interaction dans le contexte du FXS sont peu connues. Parconséquent, l'objectif de ma thèse était d'étudier les conséquences de la perturbation del’interaction mGluR5/Homer au niveau des propriétés et des fonctions de mGluR5, tellesque l'expression durant le développement, l'expression de surface et le ciblageaxonal/dendritique, l’internalisation déclenchée par l'agoniste, les dynamiques desurface, et la modulation des courants NMDAR induite par mGluR5.Dans un premier temps, nous avons étudié l’expression de surface de mGluR5dans des neurones hippocampiques in vitro issus de souris sauvages et Fmr1 KO, par destechniques d’immunofluorescence et de biotinylation. Nous avons constaté que mGluR5est plus exprimé à la surface neuronale et est différemment distribué dans les dendrites etles axones des neurones Fmr1 KO. Puis, nous avons démontré que cette altérationd’expression et de ciblage est une conséquence directe de l’altération de l’interactionmGluR5/Homer. Nous avons aussi observé que mGluR5, indépendamment del’altération de l’interaction mGluR5/Homer, ne subit pas d’internalisation suite sonactivation soutenue par DHPG dans les neurones Fmr1 KO.Dans la seconde partie de mon étude, nous avons étudié les conséquences de laperturbation de l’interaction mGluR5/Homer dans les dynamiques de surface de mGluR5et par conséquent pour la fonction du NMDAR dans les neurones Fmr1 KO. Par destechniques d'imagerie et de pistage moléculaire, nous avons constaté que l’altération ducomplexe mGluR5/Homer augmente spécifiquement la diffusion latérale à la synapsedes neurones hippocampiques Fmr1 KO in vitro.La mobilité élevée du mGluR5 conduit à une probabilité accrue d'une interactionphysique transitoire avec NMDAR dans la PSD du Fmr1 KO.Cette interaction altère la modulation, induite par mGluR5, des courantsNMDAR. En effet, en utilisant des enregistrements en patch-clamp de neuronespyramidaux de CA1 sur tranches couplés à la stimulation des fibres collatérales deSchaffer, nous avons constaté que les courants excitateurs post-synaptiques induits parNMDAR (NMDAR-EPSCs) présentent des amplitudes plus faibles dans les neuronesFmr1 KO. De plus, l'expression post-synaptique de mGluR5, induite par la dépression àlong-terme de NMDAR-EPSCs est réduite dans les neurones Fmr1 KO. Finalement,nous avons démontré que ces défauts des courants NMDAR sont dépendants de laperturbation de l’interaction mGluR5/Homer et altèrent les dynamiques de mGluR5.Cette étude pourrait avoir des conséquences dans le traitement desdysfonctionnements synaptiques du mGluR5 dans le FXS, en ciblant l’interactionmGluR5/Homer, et offre de nouvelles suggestions pour corriger la signalisationdéfectueuse sous-jacente aux troubles du spectre autistique. / Fragile X Syndrome (FXS) is the most common inherited form of intellectualdisability and autism. FXS is caused by a mutation in the fragile X mental retardation 1(Fmr1) gene which leads to the lack of the encoded FMRP protein. FMRP is an RNAbinding protein involved in protein synthesis regulation at synapses. Many evidencessuggest a central role of the Group-I metabotropic glutamate receptor subtype 5(mGluR5) in the FXS pathophysiology. In particular, an exaggerated signaling responsefollowing mGluR5 activation may underlie synaptic dysfunction in this disorder.Although much work has focused on the dysregulation of synaptic protein synthesis as aconsequence of this enhanced mGluR5 signaling, it becomes clear that in FXS there isalso an altered balance of mGluR5 association with Homer scaffolding proteins, whichare postsynaptic density (PSD) partners of mGluR5. Although an extensive literaturedescribes the mGluR5/Homer association, very little is known about the consequences ofthe disruption of this interaction in the FXS context. Therefore, the goal of my thesis wasto study the consequences of mGluR5/Homer crosstalk disruption in the Fmr1 knockout(KO) mouse model of FXS in terms of properties and functions of mGluR5, such asexpression during development, surface expression and axonal/dendritic targeting,agonist-induced internalization, surface dynamics and mGluR5-mediated modulation ofNMDA receptor (NMDAR) currents.In a first set of experiments we investigated the mGluR5 surface expression incultured hippocampal neurons from WT and Fmr1 KO mice by usingimmunofluorescence techniques and biotinylation assay. We found that mGluR5 wasmore expressed on the neuronal surface and was differently distributed in dendrites andaxons of Fmr1 KO cultured neurons. We then hypothesized that these alterations were adirect consequence of the mGluR5/Homer crosstalk disruption. We demonstrated thatthe altered expression and targeting of mGluR5 were critically dependent onmGluR5/Homer crosstalk disruption. We also observed that mGluR5 did not undergointernalization upon sustained mGluR5 activation with DHPG in Fmr1 KO neurons.This latter phenotype, however, was not dependent on the disruption of themGluR5/Homer crosstalk. Altogether, these results demonstrate that mGluR5/Homercrosstalk disruption contributes to the pathophysiology of FXS altering expression andtargeting of mGluR5 on the surface of Fmr1 KO neurons.In the second part of my study we investigated the consequences of the disruptedmGluR5/Homer crosstalk for the mGluR5 surface dynamics, and consequently forNMDAR function in Fmr1 KO neurons. Using a combination of live-cell imaging andsingle-molecule tracking, we found that mGluR5/Homer crosstalk disruption specificallyincreased the mGluR5 lateral diffusion at the synapse of cultured Fmr1 KO hippocampalneurons. The higher mGluR5 mobility resulted in an increased probability of transientphysical interaction with NMDAR in the PSD of Fmr1 KO. This interaction altered themGluR5-mediated modulation of NMDAR currents as evidenced by the two followingchanges. First, using patch-clamp recordings from CA1 pyramidal neurons, we foundthat NMDAR-mediated excitatory postsynaptic currents (NMDAR-EPSCs) evoked bySchaffer collateral stimulation showed lower amplitudes in Fmr1 KO neurons. Second,the postsynaptic expression of mGluR5 mediated long term depression (LTD) ofNMDAR-EPSCs was reduced in Fmr1 KO neurons. Finally, we demonstrated that thesedefects in NMDA currents were strongly dependent on the mGluR5/Homer crosstalkdisruption and altered mGluR5 dynamics.Altogether, our results show that mGluR5/Homer disruption contributes to themGluR5 dysregulation in Fmr1 KO neurons. This study might have implication for thetreatment of mGluR5 synaptic dysfunctions in FXS by targeting mGluR5/Homerinteraction and provide new suggestions to correct the defective signaling underlyingcognitive impairment and autism.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2015BORD0006 |
| Date | 03 February 2015 |
| Creators | Aloisi, Elisabetta |
| Contributors | Bordeaux, Università degli studi (Catane, Italie), Piazza, Pier Vincenzo, Catania, Maria Vincenza |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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