Thema dieser Arbeit ist die evolutive Optimierung der T7-RNA-Polymerase. Zur
Stabilisierung technischer oder therapeutischer RNA-Moleküle gegenüber RNAsen wäre es
wünschenswert eine RNA-Polymerase zu generieren, welche RNA vollständig aus 2’-
modifizierten Nucleotiden synthetisieren kann. Zu diesem Zweck wurde ein kombiniertes
Selektions- und Screeningverfahren zur Durchmusterung von Variantenbibliotheken der T7-
RNA-Polymerase hinsichtlich des Einbaus von 2’-Methoxy-modifizierten Nucleotiden in
RNA entwickelt. Es wurden ein gut handhabbarer, cis-regulierter Expressionsvektor sowie ein
Selektionsplasmid erzeugt, die zusammen in E. coli ein in-vivo-Selektionssystem bilden, mit
dessen Hilfe man Zellen, welche T7-RNA-Polymerase-Aktivität zeigen anhand ihrer grünen
Fluoreszenz identifizieren konnte. Durch error-prone PCR wurden Mutantenbibliotheken
generiert, und diese in das Selektionssystem eingesetzt. So konnte die Anzahl der potentiell
zu testenden Varianten erheblich gesenkt werden. Zur Bestimmung der T7-RNA-Polymerase-
Aktivität mit 2’-Methoxy-modifizierten Nucleotiden wurde ein Fluoreszenz-basierendes
Assay etabliert. Dieses Assay, das nicht mit radioaktiv-markierten Nucleotiden arbeitete und
keinen gelelektrophoretischen Separationsschritt benötigte, konnte in allen Schritten zur
parallelen Bearbeitung von 96 Proben in einem Mikrotiterplatten-Format angepasst werden,
so dass es prinzipiell hochdurchsatzfähig war und sich zum Screening umfangreicher
Variantenbibliotheken eignete. Die Assay-Reaktion kann dabei auch unkompliziert auf ein
Screening von RNA- oder DNA-Polymerase-Bibliotheken hinsichtlich anderer Eigenschaften
der Polymerase-Aktivität übertragen werden.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:11285 |
| Date | 23 August 2011 |
| Creators | Nöbel, Nico |
| Contributors | Schlegel, Martin, Mörl, Mario, Mootz, Henning, Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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