Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Despite extensive research on an effective treatment for acute renal injury (AKI), the mortality rate still remains high. Moreover, patients who survive AKI are at high risk for chronic progressive kidney disease. Mesenchymal stromal cells derived from human amniotic fluid (hAFSCs) are a new source of stem cells which express renal progenitor markers (CD24). The possibility of combining gene and cell therapy allows stem cells to be manipulated to overexpress vascular endothelial growth factor (VEGF) and hepatocyte growth factor (HGF), two of the most important growth factors for kidney regeneration. Therefore, the aim of this study was to evaluate whether hAFSCs overexpressing VEGF and HGF demonstrate a nephroprotective effect due to their mitogenic and anti-inflammatory effect, leading to a long term inhibition of fibrosis. In the first phase of this study, we isolated hAFSCs from human amniotic fluid samples, characterized their immunophenotypic properties and differentiation capacity and selected a clonal lineage which expresses CD24 and CD117 markers. This lineage was subqequently transduced with lentiviral vectors (LV) encoding VEGF and HGF. In a second phase, renal ischemia and reperfusion (IR) injury was induced in a rat model by clamping the renal pedicle for 50 minutes in 50 male Wistar rats. Treatment groups (n = 10 per group) were assigned as follows: a control group treated with Chang Medium only; a group which received non-transduced AFSC (1x106 cells/animal); a group which received AFSC transduced with LV-VEGF (1x106 cells/animal); a group which received AFSC transduced with LV-HGF (1x106 cells/animal); and a group treated with AFSC transduced both with LV-VEGF (0,5x106 cells/animal) and AFSC transduced with LV-HGF (0,5x106 cells/animal). Serum creatinine was measured at 24 hours, 48 hours and 2 months after IR injury and histological analysis was performed to analyze following parameters: tubular necrosis and hyaline cast formation by PAS and H&E staining at 48 hours, and interstitial fibrosis by Masson s Trichrome and Picrosirius Red staining at 2 months. Additionally, the expression of KI-67, α-SMA and TGF-β1 was assessed by immunohistochemistry. The results showed a beneficial effect of AFSCs delivered to rats with IR injury, which was characterized by a faster improvement in renal function and a lower fibrotic index. However, administration of hAFSCs overexpressing VEGF and HGF resulted in an even better outcome compared to non-transduced AFSCs. As early as 24 hours after AFSC delivery, a nephroprotective effect was observed after both hAFSC and hAFSC VEGF + HGF treatment, which was characterized by significantly lower creatinine values compared to those of the control group. At 48 hours, all treatment groups still demonstrated a significant increase in creatinine values compared to sham animals, except in the hAFSC HGF + VEGF group. In hAFSC HGF + VEGF and hAFSC VEGF treatment groups, a significant increase in renal tubules proliferation was observed, measured by an increase in KI-67 expression, which is probably due to the effect of VEGF overexpression. Furthermore, we observed a decrease in α-SMA and TGF-β expression at 48 hours in the non-transduced hAFSC, hAFSC HGF and hAFSC VEGF + HGF groups. As TGF-β1 is involved in transdifferentiation of tubular epithelial cells to α-SMA-positive myofibroblasts which increases extracellular matrix deposition, the reduction in the expression of α-SMA and TGF-β indicates an inhibition of fibrosis. Although VEGF and HGF have both been described to have nephroprotective properties, we interestingly observed that the hAFSC expressing both VEGF and HGF resulted in more pronounced kidney damage compared to non-treated animals when treated with 1x106 cells/animal, which suggests that toxic side effects are possibly induced by high secretion levels of growth factors. In conclusion, cellular therapy using the combination of hAFSCs transduced with lentiviral vectors encoding VEGF and HGF, resulted in a stronger nephroprotective effect than non-transduced hAFSC delivered to rats with I/R injury, which was characterized by an increased mitosis index, an improved renal function and an inhibition of genes involved in fibrosis resulting in a lower fibrotic index at two months. / O tratamento eficaz para a lesão renal aguda tem melhorado nos últimos anos, sendo objeto de inúmeras pesquisas, no entanto a taxa de mortalidade desta patologia ainda permanece elevada. Além disso, pacientes que sobrevivem após evento isquêmico possuem altos riscos de doença renal crônica progressiva. As células mesenquimais estromais do líquido amniótico humano (hAFSC) são uma nova fonte alternativa de células-tronco que expressam marcadores progenitores renais (CD24). A possibilidade da associação das terapias gênica e celular permite a manipulação dessas para superexpressar o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o fator de crescimento de hepatócitos (HGF), dois dos fatores de crescimento mais importantes para a regeneração renal. Diante disso, o objetivo desse estudo foi avaliar se as hAFSCs transduzidas com VEGF e HGF possuem maior ação nefroprotetora, por meio de efeito mitótico e anti-inflamatório a curto prazo, levando a uma inibição da fibrose a longo prazo em modelos de isquemia e reperfusão renal. Na primeira fase do experimento, isolou-se, caracterizou-se as propriedades imunofenotípicas e a capacidade de diferenciação das hAFSCs e após selecionou-se uma linhagem clonal que expressasse os marcadores CD24 e CD117. Após essa linhagem foi transduzida com vetores lentivirais (VL) codificando VEGF e HGF. Na segunda fase, induziu-se lesão de isquemia e reperfusão (IR) renal pelo clampeamento do pedículo renal por 50 minutos, em 50 ratos Wistar, machos. O grupos de tratamento foram divididos como (n=10 por grupo): grupo controle, tratado somente com o meio Chang; grupo tratado com hAFSC não transduzidas (1x106/rato); grupo tratado com hAFSC transduzidas com LV-VEGF (1x106/rato); grupo tratado com hAFSC transduzidas com LV-HGF (1x106/rato) e o grupo tratado tanto com hAFSC transduzidas com LV-VEGF (0,5x106/rato) quanto LV-HGF (0,5x106/rato). A creatinina sérica foi mensurada em 24 horas, 48 horas e 2 meses após a lesão IR e as análises histológicas foram realizadas para avaliar os seguintes parâmetros: necrose tubular e formação de cilíndros hialinos pelas colorações de PAS e H&E em 48 horas e fibrose intersticial pelas colorações Tricrômico de Masson e Picrosirius Red em 2 meses Adicionalmente, a expressão de KI-67, -SMA e TGF- foram analisadas por imunoistoquímica em 48 horas. Os resultados permitiram observar um efeito benéfico da terapia com hAFSCs em lesões de IR pela melhora mais rápida da função renal e menor índice fibrótico a longo prazo, no entanto obteve-se um efeito ainda melhor quando associaram-se as hAFSCs. transduzidas com VEGF e HGF comparado com as hAFSC não transduzidas. Já em 24 h observou-se o efeito renoprotetor nos grupos hAFSC e hAFSC VEGF + HGF pelo valor significativamente menor da creatinina comparado com o controle. Em 48h todos os grupos ainda apresentavam valores significativamente elevados de creatinina comparado com os ratos sham, exceto o grupo hAFSC HGF + VEGF. Observou-se também que os grupos hAFSC VEGF +HGF e hAFSC VEGF tiveram um aumento significativo na proliferação tubular renal, provavelmente pelo efeito da superexpressão de VEGF. Além disso, observou-se redução da expressão de α-SMA e TGF-β em 48h nos grupos hAFSCs não-transduzidas, hAFSC VEGF+HGF e hAFSC HGF. Como o TGF- β1 está envolvido na transdiferenciação de células epiteliais tubulares em miofibroblastos α-SMA-positivos, o qual aumenta a deposição de matriz extracelular, a redução na expressão de α-SMA e TGF-β são indicadoras de inibição da fibrose. Apesar de serem descritos diversos benefícios nefroprotetores do VEGF e do HGF observou-se nesse estudo uma lesão renal mais pronunciada do que o controle nos grupos hAFSC VEGF e hAFSC HGF, tanto em relação à função renal quanto à necrose tubular, o que sugere um efeito tóxico causado pela alta concentração de secreção desses fatores de crescimento. A terapia celular utilizando a combinação de hAFSCs transduzida com vetores lentivirais codificando VEGF e HGF resultou em efeito nefroprotetor ainda maior do que sua forma não transduzida após evento isquêmico renal, o qual foi caracterizado pelo aumento do índice mitogênico, melhor função renal e inibição de genes fibrogênicos, levando a um menor índice fibrótico em dois meses.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsm.br:1/4076 |
| Date | 17 August 2012 |
| Creators | Cunha, Marina Gabriela Monteiro Carvalho Mori da |
| Contributors | Pippi, Ney Luis, Graça, Dominguita Luhers, Krause, Alexandre, Guimaraes-okamoto, Priscylla Tatiana Chalfun, Krause, Luciana Maria Fontanari |
| Publisher | Universidade Federal de Santa Maria, Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, UFSM, BR, Medicina Veterinária |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSM, instname:Universidade Federal de Santa Maria, instacron:UFSM |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 500500000007, 400, 300, 300, 300, 300, 300, 300, e7d62db5-d9ba-4842-bf91-8dd7b40e28b1, bc7a2fc7-dc94-4670-b78f-cb90858d7744, 5b1f94f9-23f7-49df-a620-c35a152c9039, 4b3b8b44-7b71-4db0-afca-a4b572d23c8c, 5e151c12-d409-4b8e-a65a-da874e196fed, a45db657-fbef-4efc-a2e6-1b1ebab5c203 |
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