Étudier la mégakaryopoïèse sans utiliser de méthode systématique d'optimisation freine le développement de systèmes efficaces de culture ex vivo des mégakaryocytes (MK) qui produisent les plaquettes sanguines. Grâce à l'utilisation d'une stratégie statistique de planification d'expériences, cette étude de doctorat a permis de quantifier les effets individuels et interactifs de cytokines sur la mégakaryopoïèse in vitro et d'optimiser les rendements en MK matures et en plaquettes. Les cellules de sang de cordon enrichies en CD34+ ont été cultivées pendant 7 jours dans des conditions favorisant la différenciation mégakaryocytaire. Les cellules ainsi obtenues ont ensuite été placées dans différentes combinaisons de cytokines définies par les plans d'expériences. Les plans Plackett Burman utilisés pour analyser 13 cytokines au total, ont été peu efficaces pour identifier les facteurs importants dû à leur faible niveau de résolution. Par contre, l'analyse statistique des plans factoriels à deux niveaux a démontré qu'en présence de la thrombopoïétine (TPO), la cytokine clé de la mégakaryopoïèse, la différenciation et la maturation des MK étaient significativement stimulées par le « stem cell factor » (SCF), l'interleukine (IL)-6 et l'IL-9, alors que le « Flt-3 ligand » (FL) favorisait uniquement les MK immatures. De plus, l'érythropoïétine (EPO), souvent utilisée pour la culture des MK, était un inhibiteur de la maturation des MK. Au niveau de la polyploïdisation, une réduction de la concentration en IL-6, IL-9 et surtout TPO semble favorable. La méthode de surface dose-réponse a permis de déterminer la concentration optimale en cytokines sélectionnées (TPO, SCF, IL-6 et IL-9). Le nouveau mélange de cytokines mis au point (BS1) maximise l'expansion et la maturation des MK, tout en donnant une proportion de MK très élevée (-90%). Un autre optimum, identifié à une concentration plus élevée en SCF, permet d'augmenter davantage la production de MK matures et plaquettes mais réduit la pureté en MK. Ces méthodes statistiques constituent des outils efficaces pour analyser un système complexe de cytokines et pour développer des systèmes prometteurs de production ex vivo des MK et plaquettes à des fins cliniques. / Studying megakaryopoiesis without using a rationale optimization method limits the development of efficient ex vivo culture Systems for megakaryocytes (MK) which produce blood platelets. In this thesis, individual and interactive cytokine effects on in vitro megakaryopoiesis were quantified and yields of mature MK and platelets were optimized by applying a statistical design of experiment strategy. CD34+ -enriched cord blood cells were first cultured for 7 days in conditions favoring commitment into the MK lineage. The obtained cells were then placed in different cytokine combinations defined by experimental designs. Because of their low resolution, the Plackett and Burman designs first used to screen 13 cytokines, were not efficient to identify the important factors. In contrast, the statistical analysis of the two-level factorial designs revealed that in the presence of thrombopoietin (TPO), the key cytokine for megakaryopoiesis, MK maturation was significantly stimulated by stem cell factor (SCF), interleukin (IL)-6 and IL-9, whereas Flt-3 ligand (FL) had a positive effect only on the expansion of immature MK. Moreover, erythropoietin (EPO) was an inhibitor of MK maturation. Importantly, a reduction of the concentration of IL-6, IL-9 and especially TPO seems favorable for polyploidy. A dose-response surface methodology was then used to find the optimal concentrations of the selected cytokines (TPO, SCF, IL-6 and IL-9). The new cytokine cocktail developed (BS1) maximizes MK expansion and maturation, and gives a very high MK purity (-90%). Another optimum was also found at a higher SCF concentration, which further improves mature MK and platelet production, but reduces MK purity. These statistical methods provide an efficient tool to analyze complex Systems of cytokines and to develop promising ex-vivo MK culture Systems for clinical applications.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/18444 |
| Date | 11 April 2018 |
| Creators | Cortin, Valérie |
| Contributors | Garnier, Alain, Proulx, Chantal |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | xxxv, 142 f., application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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