Einleitung: Die Ausbildung eines Netzhautödems ist eine Hauptursache für die Verschlechterung des Sehvermögens bei ischämisch-hypoxischen und inflammatorischen Netzhauterkrankungen. Neben der erhöhten Permeabilität der Blut-Retina-Schranke trägt eine Wasserakkumulation in Netzhautzellen zur Ausbildung eines Netzhautödems bei. Müllerzellen regulieren die retinale Ionen- und Osmohomöostase, indem sie einen transzellulären Ionen- und Wassertransport vermitteln. Zudem kontrollieren Müllerzellen die Größe des Extrazellularraumes, indem sie bei neuronaler Aktivität eine Zellkörperschwellung – ausgelöst durch eine Verkleinerung der extrazellulären Osmolarität – verhindern. Unter pathologischen Bedingungen ist die Volumenregulation gestört, sodass Müllerzellen bei Hypoosmolarität anschwellen. Diese Müllerzellschwellung und eine Glutamat-induzierte Schwellung retinaler Neurone tragen zur Ausbildung eines zytotoxischen Netzhautödems bei. Neuroprotektive Faktoren wie BDNF (brain-derived neurotrophic factor) und bFGF (basic fibroblast growth factor) stimulieren das Überleben retinaler Neurone und verzögern so die retinale Degeneration.
Zielstellung: Es war zu zu ermitteln, ob BDNF die zytotoxische Schwellung von Müller- und Bipolarzellen der Rattennetzhaut verhindert.
Material und Methoden: Es wurden Netzhautschnitte und isolierte Müller- und Bipolarzellen von 55 adulten Long-Evans-Ratten (durchschnittlich 8-15 Zellen pro Versuchsreihe) verwendet. Eine osmotische Schwellung von Müller- und Bipolarzellen wurde durch eine Superfusion der Schnitte oder der Zellen mit einer 60%igen hypoosmolaren Lösung in Ab- oder Anwesenheit von Bariumchlorid induziert. Die maximale Querschnittsfläche von Müller- und Bipolarzellsomata wurde vor und nach einer vierminütigen Superfusion mit einem konfokalen Laserscanningmikroskop aufgezeichnet. Die nach der Superfusion ermittelte Querschnittsfläche wurde zu den anfänglich gemittelten Kontrollwerten in Beziehung gesetzt und prozentual als Mittelwert mit Standardfehler bestimmt. Mit Hilfe des Prism-Statistikprogramms (Graphpad) wurden die Ergebnisse mittels einem one-way ANOVA Test und einem nachfolgenden Bonferroni\''s multiple comparison Test sowie durch einen Mann-Whitney U Test statistisch analysiert.
Ergebnisse: Bei Anwesenheit von BDNF wurde die osmotische Schwellung von Müllerzellen konzentrationsabhängig sowohl in Netzhautschnitten als auch in isolierten Zellen inhibiert. Ebenso inhibierte BDNF konzentrationsabhängig die Schwellung von Bipolarzellen in Netzhautschnitten, jedoch nicht in isolierten Zellen. In Schnitten von postischämischen Netzhäuten bewirkte BDNF eine Schwellungsinhibition von Müllerzellen, nicht aber von Bipolarzellen. Mit pharmakologischen Blockern wurde die durch BDNF induzierte Signalkaskade untersucht. Die BDNF-Schwellungsinhibition von Müllerzellen wurde durch eine Aktivierung von TrkB bewirkt. Die TrkB-Aktivierung führte in Müllerzellen zu einer Transaktivierung von FGF-Rezeptoren sowie zu einer Aktivierung einer glutamatergen-purinergen Signalkaskade, von der bekannt ist, dass sie die osmotische Müllerzellschwellung unterdrückt. Da bFGF die osmotische Müllerzellschwellung inhibiert, wird die Transaktivierung der FGF-Rezeptoren wahrscheinlich durch eine BDNF-induzierte Freisetzung von bFGF aus Müllerzellen vermittelt. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass BDNF indirekt auf Bipolarzellen wirkt, indem es eine Freisetzung von Faktoren wie bFGF aus Müllerzellen induziert.
Schlussfolgerungen: Die Schwellungsinhibition von Müller- und Bipolarzellen könnte ein neuroprotektiver Mechanismus von BDNF in der Netzhaut darstellen. Während BDNF direkt TrkB auf Müllerzellen aktiviert, ist die Inhibition der Bipolarzellschwellung indirekt und durch die Ausschüttung von glialen Faktoren wie bFGF vermittelt. Der Verlust des Effektes von BDNF auf die Bipolarzellschwellung in ischämischen Netzhäuten könnte darauf zurückzuführen sein, dass gliotische Müllerzellen keine glialen Faktoren mehr in Reaktion auf BDNF freisetzen. Der Verlust des glialen Einflusses auf die Bipolarzellvolumenhomöostase könnte zur Neurodegeneration in der ischämischen Netzhaut beitragen.:Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IX
ABBILDUNGSVERZEICHNIS XI
TABELLENVERZEICHNIS XIV
1 EINLEITUNG 1
2 LITERATURÜBERSICHT 3
2.1 Sehorgan - Das Auge 3
2.2 Retina beim Mensch und Tier – Aufbau und Funktionalitäten 4
2.2.1 Bildprozessor der Tierwelt – Die Retina 10
2.2.2 Die Sehbahn – Visuelle Verarbeitung 10
2.2.3 Die Müllerzelle – Vorkommen und Funktion 13
2.2.4 Tierartlicher Vergleich der Müllerzelle 14
2.2.5 Netzhaut als Modellgewebe 16
2.3 Ödembildung: Netzhautödem – Hirnödem 17
2.3.1 Allgemein: Die Pathogenese des Ödems 17
2.3.2 Das Gehirnödem – Ursachen und Folge 17
2.3.3 Das Netzhautödem – Ursachen und Folge 18
2.3.4 Volumen- und Osmohomöostase der Retina 19
2.3.5 Osmotische Schwellung und Osmoregulation der Müllerzelle 19
2.4 Neuroprotektion durch Neurotrophine und Wachstumsfaktoren 21
2.4.1 Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) 21
2.4.2 Basic Fibroblastic Growth Factor (bFGF) 22
2.4.3 Neuroprotektive Effekte von BDNF und bFGF in der Retina 23
2.5 Zielstellung 24
2.6 Veterinärmedizinische Relevanz 25
2.6.1 Augenerkrankungen in der Klein- und Großtiermedizin 25
2.6.2 Schlussfolgerung für die Tiermedizin 31
3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 32
3.1 Versuchstiere 32
3.2 Material 32
3.2.1 Chemikalien und Reagenzien 32
3.2.2 Lösungen 33
3.2.3 Testsubstanzen 33
3.2.4 Pharmakologische Blocker 33
3.2.5 Antikörper 35
3.3 Verwendete Materialien und Geräte 36
3.4 Versuchsaufbau und Durchführung von Schwellungsversuchen 37
3.4.1 Gewebspräparation: Retina 37
3.4.2 Zellschwellungsversuche 39
3.4.3 Aufnahmetechnik 40
3.4.4 Superfusion von Retinaschnitten 40
3.4.5 Superfusion von isolierten retinalen Zellen 41
3.4.6 Das Physiologie-Modell: Isoosmolarität – Hypoosmolarität 42
3.4.7 Das Pathologie-Modell mit Barium 42
3.4.8 Tiermodell der retinalen Ischämie – Reperfusion 43
3.5 Auswertungsverfahren 43
3.5.1 Morphometrie der Somata 44
3.5.2 Statistische Analyse 44
3.6 Immunozytochemische Färbungen 45
4 ERGEBNISSE 46
4.1 Zellidentifikation in Retinaschnitten 46
4.1.1 Färbemethodik – MitoTracker Orange 47
4.1.2 Morphologie der Müllerzelle 47
4.1.3 Morphologie der Bipolarzelle 48
4.1.4 Identifikation von Müller- und Bipolarzellen 48
4.1.5 Morphologie isolierter Müller – und Bipolarzellen 49
4.2 Kontrollversuche 50
4.3 Untersuchung des Schwellungsverhaltens mit Testsubstanzen 51
4.4 Untersuchung des Schwellungsverhalten unter BDNF 52
4.4.1 Morphologie der Müllerzellen in Retinaschnitte unter BDNF 52
4.4.2 Wirkung von BDNF auf Müllerzellen in Retinaschnitten 53
4.4.3 Wirkung von BDNF auf die Schwellung von isolierten Müllerzellen 57
4.4.4 Wirkung von BDNF auf die osmotische Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 58
4.4.5 Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung von BDNF auf die osmotische Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 59
4.4.6 Wirkung von BDNF auf die Schwellung von isolierten Bipolarzellen 61
4.4.7 Wirkung von BDNF auf die osmotische Müller- und Bipolarzellschwellung in der postischämischen Retina 62
4.5 Untersuchung der osmotischen Schwellung von retinalen Zellen unter bFGF 63
4.5.1 Wirkung von bFGF auf Müllerzellen in Retinaschnitten 63
4.5.2 bFGF-induzierte Transaktivierung metabotroper Glutamatrezeptoren in Müllerzellen 65
4.5.3 Wirkung von bFGF auf die Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 65
4.6 Immunozytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in Müller- und Bipolarzellen 66
4.6.1 Kontrollaufnahmen 66
4.6.2 Immunzytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in isolierten Müllerzellen 67
4.6.3 Immunzytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in isolierten Bipolarzellen 69
5 DISKUSSION 71
5.1 Osmotische Volumenregulation bei Müller- und Bipolarzellen 71
5.2 Immunozytochemische Lokalisation von BDNF und TrkB 73
5.3 Inhibition der osmotischen Schwellung von Müller- und Bipolarzellen durch BDNF 75
5.4 TrkB-Aktivierung in Müllerzellen durch BDNF 77
5.5 Abhängigkeit des BDNF-Effekts von einer Transaktivierung von FGF-Rezeptoren 78
5.6 Indirekte Wirkung von BDNF auf die Bipolarzellschwellung durch gliale Faktoren 79
5.7 Abhängigkeit der BDNF-Wirkung von der Transaktivierung weiterer Rezeptoren 80
5.8 BDNF-induzierte Aktivierung von Ionenkanälen in Müllerzellen 81
5.9 BDNF-induzierte Signalkaskade der Inhibition der retinalen Zellschwellung 82
5.10 Neuroprotektive Wirkung von BDNF 84
6 ZUSAMMENFASSUNG 86
7 SUMMARY 88
8 BILDQUELLENVERZEICHNIS 90
9 LITERATURVERZEICHNIS 91
DANKSAGUNG 109 / Introduction: Tissue edema is a major blinding complication of ischemic-hypoxic and inflammatory retinal diseases. In addition to the hyperpemeability of the blood-retinal barrier, water accumulation in retinal cells resulting in cellular swelling may contribute to the development of retinal edema. Müller glial cells regulate the retinal ion and water homeostasis by allowing transcellular ion and water fluxes. During neuronal activity Müller cells control the extracellular space volume by autocrine inhibition of cellular swelling caused by the reduction of extracellular osmolarity. However, under pathological conditions, Müller cells are not capable to regulate their volume so that they swell rapidly under hypoosmolarity. The osmotic swelling of Müller glial cells and the glutamate induced swelling of retinal neurons contribute to the development of cytotoxic retinal edema. Various neuroprotective factors including brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) stimulate the survival of retinal neurons and thus delay the retinal degeneration.
Objective: The objective of the study is to determine whether BDNF inhibits the osmotic swelling of Müller and bipolar cells of the rat retina.
Material and Methods: Retinal slices and freshly isolated Müller and bipolar cells of 55 adult Long-Evans rats (in average 8-15 cells per trial) were used. Osmotic swelling of Müller and bipolar cells was induced by superfusion of retinal slices or isolated cells with a 60% hypoosmotic extracellular solution in the absence or presence of barium chloride. The maximal cross-sectional area of Müller and bipolar cell somata was recorded before and after a four minute-long superfusion by using a laser scanning microscope. To determine the extent of cell soma swelling, the cross-sectional area of the cell body extent after superfusion was related to the former averaged cross-sectional area. Results were given as means with standard error as percent values. Statistical analysis was made with Prism (Graphpad) and the significance was determined by the One-way ANOVA test followed by Bonferroni\''s multiple comparison test and the Mann-Whitney U test, respectively.
Results: We found that BDNF inhibits dose-depending the osmotic swelling of Müller cells in retinal slices and of isolated cells. BDNF also inhibited dose-depending the osmotic swelling of bipolar cells in retinal slices; however, it did not inhibit the osmotic swelling in isolated bipolar cells. In slices of postischemic retinas, BDNF inhibited the swelling of Müller cells but not the swelling of bipolar cells. The BDNF induced signal transduction cascade was examined by simultaneous administration of blocking agents with the receptor agonists in the hypoosmotic solution. The BDNF-induced inhibition of the osmotic Müller cell swelling was mediated by activation of TrkB. Activation of TrkB in Müller cells results in transactivation of FGF receptors and in an activation of a glutamatergic-purinergic signal transduction cascade which is known to inhibit the osmotic swelling of the cells. Since bFGF also inhibits the osmotic swelling of Müller cells, it can be assumed that the transactivation of FGF receptors is mediated by a BDNF-induced release of bFGF from Müller cells. The results suggest that the effect of BDNF on bipolar cells is indirect by inducing a subsequent release of glial factor from Müller cells such as bFGF.
Conclusion: The results show that BDNF inhibits the osmotic swelling of Müller and bipolar cells. The inhibition of cytotoxic cell swelling may contribute to the neuroprotective action of BDNF in the retina. While BDNF acts directly in Müller cells, the BDNF-induced inhibition of the bipolar cell swelling is indirect and mediated by the release of glial factors such as bFGF from Müller cells. The abrogation of the BDNF-induced inhibition of the osmotic bipolar cell swelling in the postischemic retina could be explained with the impairment of the release of glial factors by Müller cells. The abrogation of the Müller cell-mediated regulation of the bipolar cell volume could contribute to the neuronal degeneration in the ischemic retina.:Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IX
ABBILDUNGSVERZEICHNIS XI
TABELLENVERZEICHNIS XIV
1 EINLEITUNG 1
2 LITERATURÜBERSICHT 3
2.1 Sehorgan - Das Auge 3
2.2 Retina beim Mensch und Tier – Aufbau und Funktionalitäten 4
2.2.1 Bildprozessor der Tierwelt – Die Retina 10
2.2.2 Die Sehbahn – Visuelle Verarbeitung 10
2.2.3 Die Müllerzelle – Vorkommen und Funktion 13
2.2.4 Tierartlicher Vergleich der Müllerzelle 14
2.2.5 Netzhaut als Modellgewebe 16
2.3 Ödembildung: Netzhautödem – Hirnödem 17
2.3.1 Allgemein: Die Pathogenese des Ödems 17
2.3.2 Das Gehirnödem – Ursachen und Folge 17
2.3.3 Das Netzhautödem – Ursachen und Folge 18
2.3.4 Volumen- und Osmohomöostase der Retina 19
2.3.5 Osmotische Schwellung und Osmoregulation der Müllerzelle 19
2.4 Neuroprotektion durch Neurotrophine und Wachstumsfaktoren 21
2.4.1 Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) 21
2.4.2 Basic Fibroblastic Growth Factor (bFGF) 22
2.4.3 Neuroprotektive Effekte von BDNF und bFGF in der Retina 23
2.5 Zielstellung 24
2.6 Veterinärmedizinische Relevanz 25
2.6.1 Augenerkrankungen in der Klein- und Großtiermedizin 25
2.6.2 Schlussfolgerung für die Tiermedizin 31
3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 32
3.1 Versuchstiere 32
3.2 Material 32
3.2.1 Chemikalien und Reagenzien 32
3.2.2 Lösungen 33
3.2.3 Testsubstanzen 33
3.2.4 Pharmakologische Blocker 33
3.2.5 Antikörper 35
3.3 Verwendete Materialien und Geräte 36
3.4 Versuchsaufbau und Durchführung von Schwellungsversuchen 37
3.4.1 Gewebspräparation: Retina 37
3.4.2 Zellschwellungsversuche 39
3.4.3 Aufnahmetechnik 40
3.4.4 Superfusion von Retinaschnitten 40
3.4.5 Superfusion von isolierten retinalen Zellen 41
3.4.6 Das Physiologie-Modell: Isoosmolarität – Hypoosmolarität 42
3.4.7 Das Pathologie-Modell mit Barium 42
3.4.8 Tiermodell der retinalen Ischämie – Reperfusion 43
3.5 Auswertungsverfahren 43
3.5.1 Morphometrie der Somata 44
3.5.2 Statistische Analyse 44
3.6 Immunozytochemische Färbungen 45
4 ERGEBNISSE 46
4.1 Zellidentifikation in Retinaschnitten 46
4.1.1 Färbemethodik – MitoTracker Orange 47
4.1.2 Morphologie der Müllerzelle 47
4.1.3 Morphologie der Bipolarzelle 48
4.1.4 Identifikation von Müller- und Bipolarzellen 48
4.1.5 Morphologie isolierter Müller – und Bipolarzellen 49
4.2 Kontrollversuche 50
4.3 Untersuchung des Schwellungsverhaltens mit Testsubstanzen 51
4.4 Untersuchung des Schwellungsverhalten unter BDNF 52
4.4.1 Morphologie der Müllerzellen in Retinaschnitte unter BDNF 52
4.4.2 Wirkung von BDNF auf Müllerzellen in Retinaschnitten 53
4.4.3 Wirkung von BDNF auf die Schwellung von isolierten Müllerzellen 57
4.4.4 Wirkung von BDNF auf die osmotische Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 58
4.4.5 Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung von BDNF auf die osmotische Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 59
4.4.6 Wirkung von BDNF auf die Schwellung von isolierten Bipolarzellen 61
4.4.7 Wirkung von BDNF auf die osmotische Müller- und Bipolarzellschwellung in der postischämischen Retina 62
4.5 Untersuchung der osmotischen Schwellung von retinalen Zellen unter bFGF 63
4.5.1 Wirkung von bFGF auf Müllerzellen in Retinaschnitten 63
4.5.2 bFGF-induzierte Transaktivierung metabotroper Glutamatrezeptoren in Müllerzellen 65
4.5.3 Wirkung von bFGF auf die Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 65
4.6 Immunozytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in Müller- und Bipolarzellen 66
4.6.1 Kontrollaufnahmen 66
4.6.2 Immunzytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in isolierten Müllerzellen 67
4.6.3 Immunzytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in isolierten Bipolarzellen 69
5 DISKUSSION 71
5.1 Osmotische Volumenregulation bei Müller- und Bipolarzellen 71
5.2 Immunozytochemische Lokalisation von BDNF und TrkB 73
5.3 Inhibition der osmotischen Schwellung von Müller- und Bipolarzellen durch BDNF 75
5.4 TrkB-Aktivierung in Müllerzellen durch BDNF 77
5.5 Abhängigkeit des BDNF-Effekts von einer Transaktivierung von FGF-Rezeptoren 78
5.6 Indirekte Wirkung von BDNF auf die Bipolarzellschwellung durch gliale Faktoren 79
5.7 Abhängigkeit der BDNF-Wirkung von der Transaktivierung weiterer Rezeptoren 80
5.8 BDNF-induzierte Aktivierung von Ionenkanälen in Müllerzellen 81
5.9 BDNF-induzierte Signalkaskade der Inhibition der retinalen Zellschwellung 82
5.10 Neuroprotektive Wirkung von BDNF 84
6 ZUSAMMENFASSUNG 86
7 SUMMARY 88
8 BILDQUELLENVERZEICHNIS 90
9 LITERATURVERZEICHNIS 91
DANKSAGUNG 109
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:13335 |
| Date | 05 June 2015 |
| Creators | Berk, Benjamin-Andreas |
| Contributors | Seeger, Johannes, Reichenbach, Andreas, Franze, Kristian, Universität Leipzig, Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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