El desenvolupament de resistència als fungicides per part de molts patógens enpostcollita de fruites i vegetals, conjuntament amb una preocupació creixent de lasocietat respecte als perills sanitaris i mediambientals que comporten els pesticides i elsseus residus, han generat un gran interès pel desenvolupament de mètodes alternatiusals productes químics de síntesi. El control biològic mitjançant la utilització demicroorganismes antagònics s'ha presentat com una de les alternatives mésprometedores al control químic. L'esforç que la investigació dedica a aquesta àrea haincrementat d'una manera espectacular, i així s'està començant a reflexar en el nombred'agents de biocontrol disponibles en el mercat o en fase de recerca. Entre ells destacala soca CPA-1 del llevat Candida sake, aillada de la superfície de pomes en ellaboratori de Patologia del Centre UdL-IRTA. Aquesta soca ha demostrat tenir unabona capacitat antagònica enfront els principals fongs patògens en postcollita de fruitade llavor. Fins al moment, C. sake ha estat patentada a Espanya i cinc països més. Noobstant, cara a la comercialització d'aquest biofungicida és necessari obtenir unaformulació, que permeti una presentació adequada del producte, amb una alta viabilitati estabilitat en el temps i que faciliti la seva distribució i aplicació mitjançant lestécniques ja existents. Ademes, aquesta formulació ha de tenir una efectivitatcomparable a les cèl·lules fresques.L'objectiu de la present tesi ha estat l'estudi de les bases per a la formulació d'aquestagent de biocontrol. En primer lloc, es va estudiar la possibilitat de deshidratar aquestagent mitjançant la liofilització, avaluant els diferents factors que poden contribuir aincrementar la viabilitat, com el mètode de congelació i l'addició de substànciesprotectores (Capítol 3), i el medi utilitzat en la rehidratació de les cèl·lules liofilitzades(Capítol 4). També es va avaluar l'efectivitat de les cél·lules liofilitzades contraPínicillium expansion en pomes "Golden Delicious" i la seva estabilitat en condicionsd'emmagatzematge (Capítol 4). Ja que la manipulació fisiològica de les condicions decreixement pot afectar significativament la qualitat de les cél·lules i la sevacompetència ecològica, es van dur a terme estudis per avaluar l'efecte que té lamodificació de l'activitat aigua (ow) d'un medi de cultiu a base de melassa de sucre decanya en el potencial hídric de les cèl·lules (Capítol 5), en el creixement de C. sake, enl'acumulació de reserves endígenes i en la resistència a l'estrés hídric (Capítol 6).Finalment, basant-nos en aquests resultats, es va estudiar per primer cop la possibilitatde conservar les cèl·lules de C. sake en solucions líquides isotòniques (Capítol 7).Les cèl·lules de C. sake es van mostrar molt sensibles al procés de liofilització. La lleten pols desnatada, utilitzada al 10%, va presentar-se com un bon protector i va donarun producte sec porós i fàcilment rehidratable. Amb la utilització d'una solució protectora que contenia el 10% de llet en pols i el 10% de lactosa, es va aconseguiraugmentar la viabilitat de les cèl·lules fins el 40%. El medi de rehidratació també es vapresentar com un factor important per a la reactivado del llevat. Així, utilitzant el 10%de llet en pols com a medi de rehidratació enlloc de la solució amortidora de fosfat, laviabilitat va augmentar del 40 al 85%. Les cèl·lules liofòlitzades van reduir elpercentatge de podridures causades per P. expansion en pomes "Golden Delicious". Noobstant, la seva efectivitat va ser menor que la de les cél·lules fresques. La viabilitat delproducte liofòlitzat va disminuir fins el 10% després de 2 mesos de conservació a 4C.El potencial hídric de les cèl·lules crescudes en el medi a base de melassa amb awmodificada i sense modificar, va disminuir en disminuir l'aw del medi de cultiu.Ademes, aquesta modificació de l'aw del medi de cultiu va provocar un canvi en lesreserves endògenes de les cèl·lules de C. sake, sense afectar significativament el seucreixement quan l'aw del medi va ser de 0,98. Les cèl·lules crescudes durant 48 h en elmedi de melassa no modificat i els modificats a aw de 0,98 mitjançant l'addició deglicerol o NaCl, van presentar gran resistència a l'estrés hídric. Els principals solutsacumulats en les cèl·lules de C. sake quan Vaw del medi de cultiu es va reduir van ser elglicerol i l'arabitol.El medi de cultiu, el solut utilitzat per a disminuir el potencial hídric de les solucionslíquides i la temperatura de conservació, van influir en la viabilitat de C. sakeconservada en medi líquid, essent el medi de melassa no modificat i els modificats a aw0,98 amb glicerol o sorbitol els millors. S'ha aconseguit una formulació isotònica quedesprés de 7 mesos de conservació a 4C manté la seva viabilitat, i efectivitat contraP. expansion en pomes "Golden Delicious". Aquesta formulació es va preparar fentcrèixer les cèl·lules en el medi de melassa modificat amb sorbitol (aw 0,98) iconservant-les amb una solució isotònica de trealosa. / El desarrollo de resistencias a los fungicidas por parte de muchos patógenos,conjuntamente con un creciente interés social sobre los riesgos medioambientales ypara la salud que tienen estos pesticidas, han generado un gran interés en el desarrollode métodos alternativos a los productos químicos de síntesis. El control biológico delas enfermedades de postcosecha en fruta de pepita se ha mostrado como una de lasalternativas más prometedoras al control químico. El esfuerzo que la investigacióndedica a esta área ha incrementado de manera espectacular, y eso se está empezando areflejar en el número de agentes de biocontrol disponibles en el mercado o en fase deestudio. Entre ellos destaca la cepa CPA-1 de la levadura Candida sake aislada de lasuperfície de manzanas en el laboratorio de Patología del Centro UdL-IRTA. Esta cepaha demostrado tener gran actividad antagónica contra los principales patógenos de frutade pepita. Hasta el momento se ha patentado en España y cinco países más. Sinembargo, para su aplicación comercial, es necesario formular este agente de biocontrol,con la finalidad de presentar el producto, con una alta viabilidad y estabilidad a lo largodel tiempo y que facilite su distribución y aplicación con las técnicas ya existentes.Además, esta formulación ha de tener una efectividad comparable a la de las célulasfrescas.El objetivo de la presente tesis ha sido el estudio de las bases para la formulación deeste agente de biocontrol. En primer lugar se estudió la posibilidad de deshidratar esteagente mediante liofilización, evaluando los diferentes factores que puedan contribuir aincrementar su viabilidad, como el método de congelación y la adición de sustanciasprotectoras (Capítulo 3), y el medio utilizado para la rehidratación de las célulasliofilizadas (Capítulo 4). Se evaluó la efectividad de las células liofilizadas contraPínicillium expansion en manzanas "Golden Delicious" y su estabilidad encondiciones de almacenamiento (Capítulo 4). Como la manipulación fisiológica de lascondiciones de crecimiento pueden influir significativamente en la calidad de lascélulas y en su competencia ecológica, se llevaron a cabo estudios para evaluar elefecto que tiene la modificación de la actividad de agua (aw) de un medio de cultivo abase de melaza de azúcar de caña en el potencial hídrico de las células (Capítulo 5), enel crecimiento de C. sak�, en la acumulación de reservas endígenas y en la resistenciaal estrés hídrico (Capítulo 6). Finalmente, basándonos en estos resultados, se estudiópor primera vez la posibilidad de conservar las células de C. sak� en solucioneslíquidas isotónicas (Capítulo 7).Las células de C. sak� se mostraron muy sensibles al proceso de liofilización. La lecheen polvo desnatada utilizada al 10% se presentó como un buen protector. Además elproducto obtenido fue poroso y fácilmente rehidratable. Con la utilización de una solución protectora, que contenía el 10% de leche en polvo y el 10% de lactosa, seconsiguió aumentar la viabilidad de las células hasta el 40%. El medio de rehidratacióntambién se presentó como un factor importante para la reactivación de la levadura trassu Hofllización. Así, la viabilidad de las células de C. sake utilizando el 10% de lecheen polvo como medio de rehidratación en vez de tampón fosfato, aumentódel 40 al85%. Las células liofilizadas redujeron el porcentaje de podredumbre causado porP. expansum en manzanas "Golden Delicious". Sin embargo, su efectividad fue menorque la de las células frescas. La viabilidad del producto liofllizado disminuyó hasta el10% después de dos meses de conservación a 4C.El potencial hídrico de las células crecidas en un medio a base de melaza con awmodificada y sin modificar, disminuyó al disminuir la aw del medio de cultivo.Además, esta modificación de la aw del medio de cultivo, provocó un cambio en lasreservas endógenas de las células de C. sake sin afectar significativamente a sucrecimiento cuando la aw del medio de cultivo fue 0,98. Las células que crecierondurante 48 h en el medio de melaza no modificado y en los modificados a aw 0,98 conglicerol o NaCl presentaron una gran resistencia al estrés hídrico. Los principalessolutos acumulados en las células de C. sake cuando la aw del medio de cultivo seredujo fueron el glicerol y el arabitol.El medio de cultivo, el soluto utilizado para disminuir el potencial hídrico en lassoluciones líquidas y la temperatura de conservación, influyeron en la viabilidad deC. sake conservada en medio líquido, siendo los mejores el medio de melaza nomodificado y los modificados a aw 0,98 con glicerol o sorbito!. Se consiguió unaformulación isotónica que, después de 7 meses de conservación a 4C, mantuvo suviabilidad y efectividad contra P. expansum en manzanas "Golden Delicious". Estaformulación se preparó haciendo crecer las células en el medio de melaza modificadocon sorbitol (aw 0,98) y conservándolas con una solución isotónica de trealosa. / Biological control has emerged as the most promising alternative to chemicals incontrolling postharvest diseases of fruit and vegetables. The development of resistanceto many fungicides by major postharvest pathogens and concern for public safety havebeen the main driving force in the search for new and safer methods. The researcheffort expended in this area has increased dramatically and this is beginning to bereflected in the number of biocontrol agents available in the marketplace or in study.Among them stands out the strain CPA-1 of the yeast Candida sake, which wasisolated from the apple surface in the Pathology laboratory of the UdL-IRTA Centre.This strain has demonstrated to have antagonistic activity against the major postharvestpathogens of pome fruits. C. sake has been patented in Spain and in five othercountries. However, for commercial application, this antagonist should be formulatedin order to present the product in a usable form, with high viability, stability, safety,ease of distribution and application, and with retained biocontrol activity similar to thatof fresh cells.The objectives of the present work were to carry out fundamental and applied studiesto enable effective formulations of C. sake. Thus, dehydration of this biocontrol agentusing freeze-drying was studied. The effect of freezing method and protectants wasevaluated (Chapter 3), and the effect of rehydration media on viability examined(Chapter 4). Subsequently, the efficacy of such treatments against P�nicilliumexpansion on Golden Delicious apples, and stability of the freeze-dried C. sake cellswas also investigated (Chapter 4). Because physiological manipulation of growthconditions can significantly affect quality of cells and ecological competence studieswere carried out on the effect of different water activity (aw) treatments in molassesbasedmedia on changes in internal water potentials (Chapter 5), and on growthparameters, accumulation of endogenous reserves and water stress tolerance identified(Chapter 6). Finally, based on these studies the potential for preserving C. sake cells inisotonic solutions to conserve viability and shelf-life were evaluated for the first time(Chapter 7).C. sake cells were very sensitive to the freeze-drying process. Powdered skimmed milk(SM) used at 10% concentration was shown to give good protection to cells of C. sakeagainst freeze-drying, providing the freeze-dried product with a porous structure thatmade rehydration easier. The combination of 10% SM + 10% lactose was the bestcombination tested, with 40% of cells remaining viable after freeze-drying. Therehydration medium was shown to be a critical factor influencing the recovery ofC. sake cells. Using 10% SM as a rehydration medium instead of potassium phosphate,cell viability increased from 40 to 85%. Freeze-dried C. sake cells reduced theincidence of decay caused by P. expansum in Golden Delicious apples. However, itsefficacy was lower than that obtained with fresh cells. Stability of freeze-dried cellsdecreased during their preservation, and their viability was reduced to 10% after 2months storage at 4�C.Water potential of C. sake cells grown in molasses-based media with modified awdecreased with decreasing aw of medium. Moreover, modification of the a� of theculture medium changed the concentration of endogenous sugars and polyols withoutaffecting significantly its growth when the aw of the medium was 0.98. Cells grown for48 h in the unmodified molasses-based medium, and in those modified to 0.98 aw withthe addition of NaCl or glycerol showed high water stress resistance. The main solutesaccumulated in C. sake cells in response to lowered aw of molasses media wereglycerol and arabitol.Culture and preservation medium and temperature greatly influenced the viability ofC. sake cells in isotonic liquid solutions. Unmodified molasses medium and thosemodified to 0.98 aw with the addition of glycerol or sorbitol were shown to be the bestculture medium for cells of C. sake. This study enabled an isotonic liquid formulationof C. sake cells with retained viability and efficacy against P. expansum on GoldenDelicious apples after 7 months of storage at 4�C to be achieved. This formulation wasprepared by growing the cells in sorbitol-modified molasses medium (aw 0.98) andpreserving them in an isotonic trehalose solution.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UDL/oai:www.tdx.cat:10803/8391 |
| Date | 18 December 2000 |
| Creators | Abadias i Sero, Mª Isabel |
| Contributors | Usall i Rodié, Josep, Viñas Almenar, Inmaculada, Universitat de Lleida. Departament de Tecnologia d'Aliments |
| Publisher | Universitat de Lleida |
| Source Sets | Universitat de Lleida |
| Language | Catalan |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Page generated in 0.0041 seconds