Este estudo teve por objetivos (1) estudar os efeitos de diferentes parâmetros de terapia fotodinâmica sobre a viabilidade de células planctônicas e biofilme de S. mutans UA159, (2) verificar a viabilidade de uso de um modelo para crescimento de biofilme bacteriano no estudo do processo de desmineralização, (3) avaliar a capacidade da terapia fotodinâmica em controlar o processo de desmineralização mediado por biofilme de S. mutans crescidos sobre discos de dentina bovina e (4) mensurar a capacidade da terapia fotodinâmica em promover estresse celular a S. mutans UA159 com deleção do gene VicK. Os procedimentos de terapia fotodinâmica foram realizados pela associação do fotossensibilizador Photogem® e de um LED vermelho visível (Biotable®, 630 nm, 50 mW/cm2) como fonte de luz. A viabilidade de células bacterianas foi determinada por dois métodos distintos: teste de atividade metabólica pelo uso da resazurina (etapa 1) e contagem de UFC (etapas 1,2 e 3). Microrradiografia transversal e análise da concentração de cálcio por espectrometria de absorção atômica foram os métodos de escolha para a determinação do perfil do conteúdo mineral (%vol), perda mineral integrada (PMI, %vol x m), profundidade de lesão (PL, m) e concentração de cálcio liberado em meio de cultura (mg/dL). A intensidade de fluorescência emitida pela modulação da proteína GFP após ensaio de estresse celular foi determinada por citometria de fluxo. Os diferentes parâmetros de terapia fotodinâmica foram capazes de reduzir a viabilidade de células planctônicas de S. mutans, bem como das células organizadas em biofilme (ANOVA a um critério, Games-Howell, p<0,05), sendo o resultado dose-dependente. Quando Photogem® a 0,25 mg/mL foi associado ao LED a 150 J/cm2, uma redução de aproximadamente 3,9 log10 na contagem de células viáveis provenientes de biofilme foi observada. O modelo para crescimento de biofilme permitu a progressão do processo de desmineralização (24 h PMI: 1905±391 vol% x m, PL: 69,9±12,2 m; 48 h - PMI: 3529±886 vol% x m, PL: 114,2±24,6 m; 72 h - PMI: 4186±1099 vol% x m, PL: 146,1±20,1 m) em função do tempo. As associações de Photogem® 0,25 mg/mL + LED 75 J/cm2 e Photogem® 0,25 mg/mL + LED 150 J/cm2 foram capazes de controlar por 24 h a perda mineral integrada, a profundidade de lesão e a concentração de cálcio liberada em relação ao grupo controle (ANOVA a um critério, Games-Howell, p<0,05). Os diferentes tipos de tratamento utilizados no ensaio de estresse celular (H2O2 a 0,0025%, H2O2 a 0,005%, Photogem® a 0,00625%, Photogem® a 0,0125%, LED 4,5 J/cm2, Photogem® a 0,00625% + LED 4,5 J/cm2 e Photogem® a 0,0125% + LED 4,5 J/cm2) produziram aumento significativo da fluorescência captada pela citometria de fluxo em relação ao grupo controle (água deionizada) (ANOVA a um critério, Games-Howell, p<0,05). Entretanto, diferenças significativas não foram notadas entre os grupos de tratamento. Portanto, a terapia fotodinâmica foi capaz de reduzir a viabilidade de células planctônicas e células organizadas em biofilme (S. mutans UA159), bem como controlar o processo de desmineralização mediado por bactéria durante 24 h. Além disso, pelo modelo utilizado, a terapia fotodinâmica pode ser capaz de modular estresse celular comparável àquele obtido com a utilização do peróxido de hidrogênio em diferentes concentrações. / The present study aimed (1) to assess the effects of different parameters of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) on the viability of planktonic cells and biofilm of S. mutans UA159, (2) to test the effectiveness of a biofilm model in evaluating the demineralization process, (3) to assess the influence of PACT on the control of demineralization process mediated by S. mutans biofilm growth on dentin discs, and (4) to measure the ability of PACT in promoting cellular stress on S. mutans UA159 knockout vicK gene. PACT procedures were performed by association between a photosensitizer (Photogem®) and a visible red LED (Biotable®, 630 nm, 50 mW/cm2) as light source. Viability of bacterial cells was determined by two distinct methods: resazurin assay (phase 1) and Colony Forming Unit (CFU) counts (phases 1, 2, and 3). Transversal microradiography and calcium release analysis by atomic absorption spectrometry were chosen to analyze mineral content profile (%vol), integrated mineral loss (IML, %vol x m), lesion depth (LD, m), and concentration of calcium release in culture media (mg/dL). Fluorescence intensity levels, which were modulated by expression of Green Fluorescent Protein-reporter (GFP) after cellular stress, were measured by flow cytometer. A dose-dependent effect on the reduction of viability of planktonic cells and biofilm of S. mutans was observed after application of different parameters of PACT (one-way ANOVA, Games-Howell, p<0.05). 0.25 mg/mL Photogem® plus 150 J/cm2 LED decreased in nearly 3.9 log10 the viability of S. mutans biofilm. Progression of demineralization process was correlated with the time (24 h IML: 1905±391 vol% x m, LD: 69.9±12,2 m; 48 h - IML: 3529±886 vol% x m, LD: 114.2±24.6 m; 72 h - IML: 4186±1099 vol% x m, LD: 146.1±20.1 m). Integrated mineral loss, lesion depth and concentration of calcium release were controlled for 24 h by the following associations: 0.25 mg/mL Photogem® plus 75 J/cm2 LED, and 0.25 mg/mL Photogem® plus 150 J/cm2 LED, in comparison to control group (one-way ANOVA, Games-Howell, p<0.05). Different treatments (0.0025% H2O2, 0.005% H2O2, 0.00625% Photogem®, 0.0125% Photogem®, 4.5 J/cm2 LED, 0.00625% Photogem® plus 4.5 J/cm2 LED, and 0.0125% Photogem® plus 4.5 J/cm2 LED) increased significantly the fluorescence levels emitted by S. mutans, when compared with levels of the control group (demi water) (one-way ANOVA, Games-Howell, p<0.05). However, significant statistical differences were not observed among treatment groups. Therefore, PACT was able to decrease the viability of planktonic cells and biofilm of S. mutans UA159, as well as controlling the demineralization process mediated by bacteria for 24 h. Moreover, according to present methods, PACT may modulate cellular stress similar to hydrogen peroxide.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-18082010-104126 |
| Date | 26 April 2010 |
| Creators | Silva, Thiago Cruvinel da |
| Contributors | Machado, Maria Aparecida de Andrade Moreira |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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