Titre de l'écran-titre (visionné le 5 juin 2023) / Les AAV constituent des vecteurs viraux très utilisés en thérapie génique. Cependant une limite à leur utilisation est leur large tropisme, soit leur capacité à infecter plusieurs types de cellules. Pour y remédier, il a été question dans ce projet de produire des AAV2 recombinants dont la capside a été modifiée par l'insertion d'un anticorps à domaine unique (single domain antibody, sdAb) pour permettre une transduction spécifique de cellules du cancer de l'ovaire : les SKOV3. Ces cellules expriment à leur surface le récepteur tyrosine kinase Axl et l'anticorps inséré dans la protéine VP1 de la capside virale, lui est spécifique. Les AAV contenant l'anticorps (AAV-sdAb) ont été produits par transfection transitoire de cellules HEK293SF-3F6, puis purifiés par ultracentrifugation avec différents gradients d'Iodixanol et concentrés par filtration tangentielle avec des membranes à fibres creuses (Hollow fibers). L'insertion de l'anticorps dans la capside de l'AAV2 a été faite en utilisant 2 types de séquences de liaison : une courte et une longue. La production des AAV-sdAb avec courte séquence de liaison et exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) comme gène rapporteur s'est avéré difficile alors que celle avec la plus longue séquence a permis d'obtenir des titres vingt fois plus élevés. Pour démontrer une transduction spécifique des cellules cibles SKOV3, les plasmides permettant de produire les AAV-sdAb ont été mutés pour inhiber le site d'attachement des AAV2 au sulfate d'héparine, principal récepteur auquel il se lie à la surface des cellules hôtes. Les résultats obtenus ont permis de démontrer que le tropisme des AAV2 a été altéré par les mutations et que les AAV-sdAb infectent de façon spécifique les cellules SKOV3 qui expriment le récepteur Axl auquel l'anticorps inséré est spécifique. Ce projet a ainsi démontré qu'il est possible de modifier le tropisme des AAV à l'aide d'anticorps à domaine unique. / The use of adeno-associated viruses (AAV) as vectors for gene therapy has increased in recent years. However, a major drawback to their use is the large tropism, allowing the infection of many types of cells. To overcome that issue, we incorporated in this project a single-domain antibody (sdAb) into the capsid of AAV serotype 2 (AAV2) to enable it to specifically bind to a receptor tyrosine kinase Axl expressed on the surface of ovarian cancer cells SKOV3. The sdAb against Axl was inserted into the VP1 capsid subunit of AAV2. In order to investigate their targeting efficacy, AAV with the modified capsid (AAV-sdAb) were produced by transient transfection of HEK293SF-3F6 cells, purified by ultracentrifugation using Iodixanol step-gradients and concentrated by tangential-flow filtration using Hollow fiber membranes. In this study, two types of linker sequences, short and long were used for the insertion of the sdAb into VP1. Production of infectious AAV particles expressing GFP as a reporter proved to be difficult when using the short linker sequence, while production using the longer linker led to titers twenty times higher. To prove a specific transduction of Axl-expressing cells (SKOV3), plasmids required for AAV-sdAb production were mutated to inhibit the binding of AAV2 to its main receptor on cell surface: heparan sulfate. Characterization of those AAV-sdAb showed that the mutations led to an altered tropism for AAV2's natural receptor and more importantly, the viral vectors infect specifically the Axl-expressing cells SKOV3 as a result of the inserted anti-Axl antibody. Therefore, this study proved that it is possible to modify the tropism of AAV by using a single-domain antibody.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/119105 |
| Date | 13 December 2023 |
| Creators | Ndour, Anne Marie Ndebane |
| Contributors | Gaillet, Bruno, Gilbert, Rénald |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | COAR1_1::Texte::Thèse::Mémoire de maîtrise |
| Format | 1 ressource en ligne (xii, 84 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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