As coberturas de hidroxiapatita (HAp) são utilizadas para aumentar a osteointegração em implantes de titânio (Ti), devido à sua capacidade de promover a biomineralização para corrigir defeitos esqueléticos e craniofaciais. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a influência dos revestimentos sobre culturas primárias de osteoblastos. Na primeira fase de estudos, desenvolvemos uma nova abordagem de revestimento baseada em filmes Langmuir-Blodgett (LB) de dihexadecilfosfato (DHP) e ácido octadecilfosfônico (OPA) depositados em discos Ti, e crescimento subsequente de cristais de HAp. Analisamos a viabilidade dos osteoblastos, a atividade da fosfatase alcalina (ALP) e a formação da matriz mineralizada por métodos colorimétricos e a morfologia das culturas por microscopia eletrônica de varredura e microscopia confocal. Os resultados revelaram que o revestimento DHP/HAp aumentou a viabilidade dos osteoblastos até 150% em comparação com o controle em todos os dias testados. O revestimento OPA/HAp promoveu a maior viabilidade ao 14 dias (190%). A atividade de ALP foi aumentada apenas pelo revestimento de DHP/HAp ao 14º dia em comparação com o controle e Ti limpo. A microscopia eletrônica de varredura e as microfotografias confocais revelaram diferenças morfológicas entre os osteoblastos cultivados em ambos os revestimentos, aumentando o seu número e o espalhamento. O revestimento de DHP/HAp aumentou a produção de nódulos biomineralizados. O ensaio de biomineralização pela técnica do Vermelho de Alizarina mostrou que o revestimento de OPA/HAp possuía uma concentração de cálcio (Ca2+) 1,88 vezes superior à cobertura de DHP/HAp. Uma vez que a literatura relata que o Ca2+ pode estimular ou inibir a atividade da ALP e, consequentemente, o processo de biomineralização, as diferenças no comportamento desses dois revestimentos podem estar relacionadas às diferenças de concentração de superfície de Ca2+. O bom desempenho do revestimento de DHP/HAp pode estar relacionado às características da composição química, adicionada à técnica de deposição LB. Na segunda fase da pesquisa, as monocamadas de Langmuir de DHP e dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) foram testadas e utilizadas para incorporar o paratormônio 1-34 (PTH 1-34) (DHP/Ca+PTH e DPPC/Ca+PTH, respectivamente). Também foram testadas as ações dos revestimentos DHP/HAp com PTH em solução (DHP/HAp+PTH S) e gotejado (DHP/HAp+PTH G) em culturas de osteoblastos. Um potencial zeta negativo em pH 7,4 foi encontrado (-14,9 mV) para o PTH 1-34. A isoterma de DPPC mostrou um aumento da área mínima ocupada por molécula lipídica após a injeção de PTH na subfase de água (50 ?L de solução 0,5 mg/mL) em 10,97 Å2, o que pode ser devido à inserção de PTH neste filme. A área mínima de DHP foi alterada em 2,3 Å2, o que não é estatisticamente significativo. A análise de QCM mostrou um depósito de 72,5 ng de PTH em filme de DPPC e 29,3 ng de PTH em filme de DHP para cada 25 ?g de PTH injetado na cuba de Langmuir. A viabilidade celular e a formação da matriz mineralizada de culturas de osteoblastos crescidas em DHP/Ca+PTH e revestimentos DPPC/Ca+PTH diminuíram quando comparadas com Ti limpo. Os revestimentos DHP/HAp+PTH S e DHP/HAp+PTH G mostraram ser tão eficientes quanto o Ti DHP/HAp para estimular o processo de biomineralização. Mas a cobertura de DHP/HAp+PTH G aumentou a viabilidade dos osteoblastos e a formação de matriz mineralizada quando comparada com Ti DHP/HAp. Esta é uma cobertura inovadora que abre precedentes para o uso da técnica de gotejamento em HAp para outros hormônios e drogas que agem sobre o tecido ósseo. / Due to their ability to promote biomineralization, Hydroxyapatite (HAp) coatings are used to increase the osteointegration in titanium (Ti) implants, in order to correct skeletal and craniofacial defects. The objective of the research was to evaluate the influence of the coatings on osteoblasts primary cultures. In the first phase of the research we developed a new coating approach based on Langmuir-Blodgett (LB) films of dihexadecyl phosphate (DHP) and octadecylphosphonic acid (OPA) deposited on Ti discs and subsequent growth of HAp crystals. We analyzed the osteoblast viability, alkaline phosphatase (ALP) activity and mineralized matrix formation by colorimetric methods, and the morphology of the cultures by scanning electron microscopy and confocal micrographies. The results revealed that the DHP/HAp coating increased osteoblast viability up to 150% compared to the control at all days tested. The OPA/HAp coating promoted the highest viability on the 14th day (190%). The ALP activity was enhanced only by the DHP/HAp coating on the 14th day compared to control, and clean Ti. To explore the morphology of the cells, the scanning electron microscopy and confocal micrographies were obtained, and revealed morphological differences between osteoblasts grown on both coated Ti compared to clean Ti. Both coatings increased the number and spreading of osteoblasts, while the DHP/HAp coating enhanced the production of biomineralized nodules. The Alizarin Red assay showed that OPA/HAp coating has 1.88 times higher calcium (Ca2+) concentration than DHP/HAp. The same test confirmed the increase of mineralization only by DHP/HAp coating compared to clean Ti. Since literature reports that Ca2+ can stimulate or inhibit the ALP activity and consequently, the biomineralization process, the differences on the behavior of these two coatings could be related to the Ca2+ surface concentration differences. The good performance of the DHP/HAp coating can be explained due to the characteristics of the chemical composition, added to the LB deposition technique. In the second phase of the research, Langmuir monolayers of DHP and dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC) was tested and used to incorporate 1-34 parathyroid hormone (PTH 1-34) (DHP/Ca+PTH, and DPPC/Ca+PTH, respectively). DHP/HAp coatings with PTH in solution (DHP/HAp+PTH S), and dropped (DHP/HAp+PTH G) also were tested on osteoblasts cultures. A negative zeta-potential at pH 7.4 was found (-14.9 mV) to PTH 1-34. The Langmuir isotherm of DPPC showed an increase of the minimum area occupied per lipid molecule after the PTH injection into the water subphase (50 ?L of 0.5 mg/mL solution) by 10.97 Å2, which could be due to the insertion of PTH in this film. The DHP minimum area changed by 2.3 Å2, which is not statistically significant. The QCM analysis showed the deposit of 72.5 ng of PTH on DPPC film, and 29.3 ng of PTH on DHP film for each 25 ?g of PTH injected into the Langmuir trough. The cell viability and matrix mineralization of osteoblasts cultures grown on DHP/Ca+PTH, and DPPC/Ca+PTH coatings decreased when compared to clean Ti. DHP/HAp+PTH S and DHP/HAp+PTH G coatings proved to be as efficient as Ti DHP/HAp to stimulate the biomineralization process. But DHP/HAp+PTH G increased the osteoblast viabilitiy and formation of mineralized matrix when compared to Ti DHP/HAp. This is an innovative coating that sets the precedent for the use of the drip technique on HAp for other hormones and drugs that act on bone tissue.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-07062017-130153 |
| Date | 24 March 2017 |
| Creators | Amanda Natalina de Faria |
| Contributors | Pietro Ciancaglini, Ana Paula Ramos, Luciano Caseli, Francisco de Assis Leone, Francisco Jose Albuquerque de Paula, João Martins Pizauro Júnior |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Bioquímica, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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