Einfluss schwacher Säuren auf den intrazellulären pH-Wert oviner Pansenepithelzellen - Mechanismen der Gegenregulation Müller, Frank Veterinär-Physiologisches Institut der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Die Epithelzellen der Pansenwand sind einer permanenten und sehr hohen Belastung durch intraruminale Säuren und endogen anflutende Säuren ausgesetzt. Aufgrund der zahlreichen pH-sensiblen Enzyme im Zytoplasma hätte eine anhaltende intrazelluläre Übersäuerung letale Folgen für die Zelle. So müssen Pansenepithelzellen effektive pHi-regulierende Mechanismen exprimieren, um den intrazellulären pH-Wert stabil zu halten. Daher war es das Ziel der vorliegendenden Arbeit, zu untersuchen, wie Pansenepithelzellen auf Säurebelastungen reagieren und welche Mechanismen aktiviert werden, um die Zelle vor einer Übersäuerung zu schützen. Zu diesem Zweck wurden an kultivierten Pansenepithelzellen Versuchsserien mit unterschiedlichen Fragestellungen durchgeführt. Dazu wurden Pansenepithelzellen aus dem Pansenvorhof frisch geschlachteter Schafe isoliert und auf kollagenisierten Deckgläschen kultiviert. Der Nachweis, dass es sich um epitheliale Zellen handelt, wurde durch positive Zytokeratinfärbung erbracht. Für die pHi-Studien wurden die kultivierten Pansenepithelzellen mit dem pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff BCECF beladen und der intrazelluläre pH-Wert mittels eines Lumineszenzspektrometers aufgezeichnet. Die Versuche des ersten Abschnitts sollten den Einfluss von Butyrat sowie die pHi-Regulation in Abwesenheit von HCO3- charakterisieren. Dabei wurden folgende Befunde erhoben: Die pHi-Gegenregulation nach intrazellulärer Ansäuerung mittels NH4+/NH3-Präpuls war durch EIPA (10 µM) oder HOE-694 (200 µM), spezifischen Hemmstoffen des Na+/H+-Austauschers, hemmbar. Butyrat (20 mM) führte zu einer schnellen intrazellulären Ansäuerung. Daraufhin erholte sich der intrazelluläre pH-Wert (Recovery). EIPA (10 µM) oder HOE-694 (200 µM) hemmten die pHi-Recovery nach butyratinduzierter intrazellulärer Azidifizierung.Die Untersuchungen des zweiten Abschnitts sollten die pHi-Regulation in Anwesenheit von CO2/HCO3- (5%/20 mM) charakterisieren und ergaben folgende Befunde: CO2 führte zu einer schnellen intrazellulären Ansäuerung, gefolgt von einer Erholung des pHi. Die pHi-Gegenregulation nach CO2-induzierter intrazellulärer Ansäuerung war durch 100 µM DIDS, einem Hemmstoff von HCO3--Transportsystemen, blockiert. Der letzte Versuchsabschnitt sollte klären, inwiefern der intrazelluläre pH-Wert durch Laktat, das im intrazellulären SCFA-Katabolismus entsteht, beeinflusst wird und welcher pHi-Regulationsmechanismus vorrangig an der Gegenregulation beteiligt ist. Die Untersuchungen brachten folgende Ergebnisse: Extrazellulär zugegebenes Laktat (20 mM) führte zu einer intrazellulären Ansäuerung. Nach Entfernung des extrazellulären Laktats erholte sich der intrazelluläre pH-Wert. pCMBS (400 µM) oder Phloretin (20 µM), Hemmstoffe des H+/Monokarboxylat-Kotransporters, hemmten sowohl die laktatinduzierte intrazelluläre Ansäuerung als auch die pHi-Recovery nach Entfernung von extrazellulärem Laktat. Schlussfolgerungen: Um sich vor einer intrazellulären Übersäuerung mit letalen Folgen zu schützen, bilden die Epithelzellen des Pansens effektive Schutzmechanismen aus. So wird der Protoneneinstrom durch die hohe exogene Säureanflutung über einen Na+/H+-Austauscher, einen Na+-HCO3--Kotransporter und/oder einen Na+-HCO3-/Cl--Austauscher kompensiert. Dem Problem der endogenen Säurebelastung begegnen die Pansenepithelzellen durch Expression eines H+/Monokarboxylat-Kotransporters (MCT), der die Zelle von den Kataboliten des intrazellulären SCFA-Abbaus, d.h. von den Monokarboxylsäuren, befreit. / Effect of weak acids on intracellular pH in ovine ruminal epithelial cells - mechanisms of counter-regulation Frank Müller Department of Veterinary Physiology, Leipzig University, Ruminal epithelial cells are permanently exposed to enormous amounts of intraruminal and endogenous acids. Since the latter of cytoplasmic enzymes is highly pH-sensitive, a long lasting intracellular acidification might cause severe damage and cell death. To maintain a stable cytoplasmic pH, ruminal epithelial cells have to express effective pH-regulating systems. The aim of this study was to investigate effects of weak acids on intracellular pH in ruminal epithelial cells and the active mechanisms to prevent intracellular acidification. Therefore different experiments on cultivated ruminal epithelial cells were performed. Epithelial cells were isolated from the atrium of sheep rumen and cultivated on collagen-coated coverslips. The epithelial origin of the cells was determined by positive staining for cytokeratin. For measurement of intracellular pH, cells were loaded with the pH sensitive dye BCECF. Intracellular pH was recorded by using a luminescence spectrometer. In the first set of experiments, effect of butyrate as well as regulation of pHi in the absence of bicarbonate had to be established. The following results were obtained: pHi-counter-regulation following intracellular acidification by NH4+/NH3 prepulse was inhibited by EIPA (10 µM) or HOE-694 (200 µM), specific inhibitors of Na+/H+ exchange. Butyrate (20 mM) led to a rapid fall in pHi. Intracellular acidification was followed by a pHi recovery. pHi recovery from butyrate-induced acid load was inhibited by EIPA (10 µM) and HOE-694 (200 µM), respectively. In the second set of experiments, regulation of pHi in the presence of CO2/HCO3- (5%/20 mM) was characterized. The following results were obtained: CO2 led to a rapid intracellular acidification, followed by a recovery of pHi.pHi recovery from CO2-induced intracellular acidification was blocked by DIDS (100 µM), a known inhibitor of HCO3--transporting systems. In the last set of experiments, influence of lactate - derived from intracellular SCFA catabolism - on pHi was determined. It had also to be established, which mechanism is mainly expressed to extrude lactate. The following results were obtained: Extracellular lactate (20 mM) led to a intracellular acidification.Removing extracellular lactate induced a recovery of pHi. Both intracellular acidification and pHi recovery were blocked by pCMBS (400 µM) or phloretin (20 µM), known inhibitors of H+/monocarboxylate cotransporter (MCT). Conclusions: To prevent intracellular acidification and cell death, ruminal epithelial cells express effective protective mechanisms. A Na+/H transporter, a Na+-HCO3- cotransporter and/or a Na+-HCO3-/Cl- transporter compensate the great H+ influx evoked by exogenous acids. Monocarboxylates derived from intracellular SCFA catabolism can effectively be extruded by a H+/monocarboxylate cotransporter, a prerequisite for stabilizing pHi in ruminal epithelial cells.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa.de:bsz:15-qucosa-36599 |
| Date | 28 November 2004 |
| Creators | Müller, Frank |
| Contributors | Universität Leipzig, Veterinärmedizinische Fakultät |
| Publisher | Universitätsbibliothek Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
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