Kardiovaskuläre Erkrankungen, wie beispielsweise der Herzinfarkt, sind die häufigste Todesursache weltweit. Bei einem Herzinfarkt sterben Areale des Herzens aufgrund einer Unterversorgung mit Blut ab. Da das Herzmuskelgewebe ein sogenanntes terminal differenziertes Gewebe ist, kommt es zu keiner Regeneration des Gewebes, mit der Folge einer Herzinsuffizienz beziehungsweise dem Tod des Patienten. Eine alternative Behandlungsmöglichkeit zu einer Herztransplantation stellt das Tissue Engineering dar. Mit Hilfe des Tissue Engineerings können dreidimensionale Gewebe aufgebaut und kultiviert werden, um auf diese Weise ein funktionelles Gewebe zu erhalten, durch welches das abgestorbene Gewebeareal des Herzens zukünftig auch ersetzt werden könnte.
In der vorliegenden Arbeit wurden notwendige Technologien für den Aufbau von Geweben entwickelt sowie erste Versuche für die Erzeugung eines funktionellen Herzmuskelgewebes durchgeführt. Beim Aufbau von dreidimensionalen Geweben finden Trägerstrukturen Anwendung, die mit Zellen besiedelt werden. Solche Trägerstrukturen können aus biologischen oder synthetischen Polymeren hergestellt sein oder aus der extrazellulären Matrix eines dezellularisierten Gewebes bestehen. Für eine standardisierte Dezellularisierung von Geweben wurde eine computergesteuerte Pumpeneinheit, für die Herstellung von Nanofaserscaffolds eine Elektrospinninganlage entwickelt. Mit Hilfe der Dezellularisierungseinheit können komplexe Organe, wie ein Herz im Ganzen, reproduzierbar dezellularisiert werden. Untersuchungen der mittels Elektrospinning hergestellten Nanofaserscaffolds, welche als Alternative zu der dezellularisierten, natürlichen Matrix eingesetzt werden können, zeigten bei allen hergestellten Zusammensetzungen eine Orientierung der Zellen entlang der Fasern.
Die Kultivierung von Zellmatrixkonstrukten erfolgt im Tissue Engineering häufig unter dynamischen Bedingungen. Hierfür wurde ein mobiler Stand Alone Inkubator mit der erforderlichen Peripherie für eine Kultur unter Perfusion des Gewebes entwickelt. Als Weiterentwicklung des Stand Alone Inkubators ist eine modulare Bioreaktorplattform, bestehend aus Wärmetauscher, Beutelpumpe und Gasaustauscher, aufgebaut worden. In dieses System kann über Standard Anschlüsse jegliche Art von Bioreaktor in das System eingebunden werden. Durch die Kompaktheit des Systems ist es möglich mehrere Ansätze parallel auf engem Raum durchzuführen. Die Funktion der Plattform, wurde in der vorliegenden Arbeit durch die Gewebekultur einer nativen porzinen Karotis nachgewiesen.
Für den Aufbau des kardialen Gewebes dient die small intestinal submucosa ohne Serosa (SISser) als Trägerstruktur. Der Aufbau des Gewebekonstrukts erfolgte in verschiedenen Ansätzen unter Einsatz verschiedener Zellarten. Native, aus Herzbiopsien generierte Cardiosphere derived cells (CDCs) verteilten sich gleichmäßige über die Oberfläche der Matrix, jedoch konnten immunhistologisch keine spezifischen kardialen Marker bei den artifiziellen Geweben nachgewiesen werden. Zellmatrixkonstrukte aus einer Mono Kultur von Kardiomyozyten, differenziert aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS Zellen) sowie einer Co Kultur dieser Kardiomyozyten mit mesenchymalen Stammzellen und Zellen aus einer Herzbiopsie zeigten nach wenigen Tagen in Kultur ein kontraktiles Verhalten. Immunhistologische Färbungen der beiden Gewebe bestätigten die Expression der spezifischen kardialen Marker, wie beispielsweise kardiales Troponin T, kardiales Troponin C und alpha Actinin. Die Kardiomyozyten der Mono Kultur sind jedoch nicht über die gesamte Matrixoberfläche verteilt, sondern bilden Aggregate. Bei der Co Kultur kann eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf der Matrix beobachtet werden. Der vielversprechendste Ansatz für den Aufbau eines Herzmuskelgewebes, welches als Implantat oder Testsystem eingesetzt werden kann, bildet nach den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen, ein Konstrukt aus der SISser und der Co Kultur der Zellen. Allerdings muss die Zusammensetzung der Co Kultur sowie das Verhältnis der Zellzahlen optimiert werden. / Cardiovascular diseases as myocardial infarction are the most frequent cause of death worldwide. During a myocardial infarction, areas of the heart are being damaged because of an insufficient nutrient supply. Heart tissue is a terminal differentiated tissue, this means that it can’t be regenerated by itself. The consequence of this characteristic is a heart insufficiency or the death of the patient. An alternative treatment to heart transplantation is promised by tissue engineering. By using the methods of tissue engineering, cells can be cultured on a scaffold to generate a mature tissue, which can be used to replace the damaged areas of the heart.
In the present work systems for the generation of tissues have been developed and first experiments to build up a functional cardiac patch were performed. To generate three-dimensional tissues, scaffolds colonized with cells are necessary. These scaffolds can be produced with biological or synthetic polymers or even decellularized tissues can be used. A computer controlled decellularization platform was designed to ensure a standardized, reproducible decellularization of complex organs like hearts. Furthermore, an electrospinning device was developed for the production of nanofiber scaffolds. On such matrices, seeded cells grow along the fibers.
Most cell-matrix-constructs are cultured under dynamic conditions in tissue engineering. A stand alone incubator system containing the required periphery to apply different culture conditions was developed. As further development a compact modular bioreactor platform consisting of a heat exchanger, a bag pump and a gas exchanger was established. All kinds of bioreactors can be enclosed to the system via standard Luer Lock Connectors. Due to the compactness of the system, it is possible to parallelize and run experiments easily on narrow space. The functionality of the platform was demonstrated by a tissue culture of a native porcine carotid artery.
The small intestinal submucosa without serosa (SISser) was employed as matrix for the development of a functional cardiac patch. In different experiments diverse cell types were used to generate a cardiac construct. Cardiosphere derived cells (CDC) seeded on the SISser showed an equal distribution all over the surface of the matrix, but no expression of specific cardiac markers. Constructs consisting of a mono culture of induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes (CM iPS cells) or a co culture of CM iPS cells, mesenchymal stem cells and cells isolated form a heart biopsy showed a contraction of the whole matrix after a few days in culture. Furthermore, cardiac markers like cardiac troponin T, cardiac troponin C and alpha actinin could be observed by immunohistological staining. Regarding the morphology of the different tissues, the mono culture of the CM iPS cells formed agglomerates on the surface of the matrix whereas the co culture showed a well distribution of the cells all over the surface of the matrix. Consequently, the co culture on the SISser is the most promising approach for the development of a functional cardiac patch. However, the combination of cell types within the co culture and their ratio has to be optimized.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:14243 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Schürlein, Sebastian |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/doku/lic_mit_pod.php, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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