Le gène Notch3 code pour un récepteur transmembranaire hétérodimérique exprimé principalement dans les cellules musculaires lisses des petites artères. Les travaux de ces dernières années ont montré que le récepteur Notch3 joue un rôle clé dans la physiologie et la pathologie des petites artères. Chez la souris, Notch3 est requis pour l’intégrité structurale et fonctionnelle des artères de résistance en contrôlant l’identité artérielle, la maturation postnatale des cellules musculaires lisses et le tonus myogénique des artères de résistance. Chez l’Homme, les maladies des petites artères cérébrales (MPAC) regroupent un ensemble hétérogène de maladies parmi lesquelles un petit pourcentage, probablement encore sous-estimée, est héréditaire. A ce jour, très peu de gènes responsables de formes familiales de MPAC ont été identifiés. CADASIL est la forme familiale la plus fréquente de MPAC causée par des mutations du gène NOTCH3. Il s’agit de mutations extrêmement stéréotypées siégeant dans les répétitions EGF qui constituent le domaine extracellulaire de Notch3. Les résultats du laboratoire suggèrent fortement que l’effet pathogène de ces mutations résulte de l’acquisition par le récepteur muté d’une nouvelle fonction. Les deux objectifs de ce travail ont été : 1°) Tester l’hypothèse qu’il existe des maladies des petites artères cérébrales causées directement par une modification de l’activité du récepteur Notch3 2°) Identifier les effecteurs du récepteur Notch3 dans le contexte du développement et de la maturation des artères cérébrales Nous avons identifié chez une patiente présentant une MPAC distincte de CADASIL une nouvelle mutation siégeant dans le domaine d’hétérodimérisation du récepteur Notch3. In vitro, la mutation L1515P induit une activation ligand indépendante du récepteur Notch3. L’analyse biochimique suggère que cette activation est causée par une déstabilisation du domaine d’hétérodimérisation de Notch3.Nous avons réalisé une analyse du transcriptome des artères caudales de souris Notch3-/- et Notch3+/+. Cette analyse a permis d’identifier un groupe de 17 gènes régulés par Notch3 dans l’artère caudale ou les artères cérébrales. L’invalidation du facteur de transcription CSL/RBPJK dans les cellules musculaires lisses, pendant la période postnatale immédiate, phénocopie les altérations structurales et moléculaires observées chez les souris Notch3-/-. L’administration chez la souris d’un inhibiteur pharmacologique de la voie Notch a permis d’identifier 6 gènes (Grip2, Nrip2, Kv1.5, Pgam2, Susd5, Xirp1), en plus de Notch3, dont l’expression dans les artères cérébrales est rapidement diminuée par ce traitement. Nous avons ensuite concentré nos efforts sur le gène Grip2 dont l’expression était la plus fortement diminuée dans les différents modèles d’inactivation de la voie Notch. Grip2 était jusqu’alors connu pour son interaction avec les récepteurs au glutamate dans les neurones. Nous avons montré que Grip2 était également exprimé dans les cellules musculaires lisses vasculaires et identifié une isoforme vasculaire régulée spécifiquement par Notch3/CSL/RBPJK. L’analyse des souris Grip2neo/neo, exprimant une protéine Grip2 tronquée dans sa partie N-terminale, a révélé une atteinte sélective du tonus myogénique des artères cérébrales.En conclusion, nous avons démontré l’existence d’une mutation activatrice de NOTCH3 associée à une MPAC chez l’Homme. Nos résultats indiquent que dans le contexte de la maturation des artères cérébrales, la fonction de Notch3 est médiée par le facteur de transcription CSL/RBPJK dans les cellules musculaires lisses durant la période postnatale immédiate. Nous avons identifié plusieurs nouveaux effecteurs potentiels de Notch3 et validé l’un d’entre eux, Grip2, pour son implication dans les réponses myogéniques des artères cérébrales. Nous proposons que des mutations dans les gènes codant pour ces effecteurs puissent rendre compte de certaines formes monogéniques de MPAC. / Notch3 encodes a transmembrane receptor primarily expressed in arterial smooth muscle cells. Human and mouse genetics studies demonstrated that Notch3 is a key player in physiology and diseases of small vessels. Studies in mice revealed that Notch3 is required to generate functional arteries in regulating arterial differentiation, maturation of vascular smooth muscle cells and myogenic tone. Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical infarcts and Leukoencephalopathy (CADASIL) is the most frequent hereditary small vessels disease in human adults caused by NOTCH3 mutations. Pathogenic mutations lead to an odd number of cysteine residues within the NOTCH3 extracellular domain. Data from the laboratory suggest a model that invokes novel pathogenic roles from the mutant NOTCH3 protein. The main goals of this work are: 1°) To determine if there is small vessels disease caused by modification of Notch3 activity 2°) To identify Notch3 effectors involved in development and maturation of cerebral arteries We identified a novel heterozygous missense mutation (L1515P) in the heterodimerization domain of NOTCH3 in a patient with cerebral small vessel distinct from CADASIL. In vitro analysis showed that the L1515P mutant exhibits increased canonical NOTCH3 signaling in a ligand-independent manner. Biochemical analysis suggests that the mutation renders NOTCH3 hyperactive through destabilization of the heterodimer. Transcriptome analysis using tail arteries of Notch3-/- and Notch3+/+ mice identified a core set of 17 novel Notch3-regulated genes confirmed in tail or brain arteries. Postnatal deletion of RBP-Jκ in smooth muscle cells recapitulated the structural, functional, and molecular defects of brain arteries induced by Notch3 deficiency. Transient in vivo blockade of the Notch pathway with γ-secretase inhibitors uncovered, in addition to Notch3, 6 immediate responders, including the voltage-gated potassium channel Kv1.5, which opposes to myogenic constriction of brain arteries, and the glutamate receptor-interacting protein-2, with no previously established role in the cerebrovasculature. We identified a vascular smooth muscle cell isoform of Grip2. We showed that Notch3-RBP-Jκ specifically regulates this isoform. Finally, we found that cerebral arteries of glutamate receptor-interacting protein-2 mutant mice, which express an N-terminally truncated glutamate receptor-interacting protein-2, exhibited selective attenuation of pressure-induced contraction. In conclusion, we have demonstrated the existence of a NOTCH3 activating mutation associated with small vessels disease in human. Our results show that, in the context of cerebral arteries maturation, Notch3 functions are mediated by CSL/RBPJK transcription factor. We have identified several new Notch3 effectors and validated Grip2 as a novel regulator of myogenic tone in cerebral arteries. One can expect that mutations in these Notch3-regulated genes could be responsible of some monogenic form of small vessel diseases of the brain.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2012PA05T043 |
| Date | 21 November 2012 |
| Creators | Fouillade, Charles |
| Contributors | Paris 5, Joutel, Anne |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image |
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