Em procariotos, RNAs antisense (asRNAs) constituem a classe de RNAs não codificantes (ncRNAs) mais numerosa detectada por métodos de avaliação de transcritoma em larga escala. Apesar da grande abundância, pouco se sabe sobre mecanismos regulatórios e aspectos da conservação evolutiva dessas moléculas, principalmente em arquéias, onde o mecanismo de degradação de RNAs dupla fita (dsRNAs) é um fenômeno pouco conhecido. No presente estudo, utilizando dados de dRNA-seq, identificamos 1626 inícios de transcrição primários antisense (aTSSs) no genoma de Halobacterium salinarum NRC-1, importante organismo modelo para estudos de regulação gênica no domínio Archaea. Integrando dados de expressão gênica obtidos a partir de 18 bibliotecas de RNA-seq paired-end, anotamos 846 asRNAs a partir dos aTSSs mapeados. Encontramos asRNAs em ~21% dos genes anotados, alguns desses relacionados a importantes características desse organismo como: codificadores de proteínas que constituem vesículas de gás e da proteína bacteriorodopsina, além de vários genes relacionados a maquinaria de tradução e transposases. Além desses, encontramos asRNAs em genes pertencentes a sistemas de toxinas-antitoxinas do tipo II e utilizando dados públicos de dRNA-seq, evidenciamos que esse é um fenômeno que ocorre em bactérias e arquéias. A interação de um ncRNA com seu RNA alvo pode ser dependente de proteínas, em arquéias, a proteína LSm é uma chaperona de RNA homóloga a Hfq de bactérias, implicada no controle pós-transcricional. Utilizamos dados de RIP-seq de RNAs imunoprecipitados com LSm e identificamos 91 asRNAs interagindo com essa proteína, para 81 desses, o mRNA do gene sense também foi encontrado interagindo. Buscando por aTSSs presentes nas mesmas regiões de genes ortólogos, identificamos 160 aTSSs que dão origem a asRNAs em H. salinarum possivelmente conservados em Haloferax volcanii. A expressão dos asRNAs anotados foi avaliada ao longo de uma curva de crescimento e em uma linhagem knockout de um gene que codifica uma RNase R, possível degradadora de dsRNAs em arquéias. Encontramos um total de 144 asRNAs diferencialmente expressos ao longo da curva de crescimento, para 56 desses o gene sense também está diferencialmente expresso, caracterizando possíveis mecanismos de regulação em cis por esses RNAs. Na linhagem knockout, encontramos cinco asRNAs diferencialmente expressos e apenas para um desses o gene sense também está diferencialmente expresso, resultado que não nos permitiu inferir um possível papel de degradação de dsRNAs da RNAse R em H. salinarum NRC-1. Nesse trabalho apresentamos um mapeamento completo do transcritoma antisense primário de H. salinarum NRC-1 com resultados que consistem em um importante passo na direção da compreensão do envolvimento da transcrição antisense na regulação gênica pós-transcricional desse organismo modelo do terceiro domínio da vida. / Antisense RNAs (asRNAs) constitute the most numerous class of non-coding RNAs (ncRNAs) detected by transcriptome highthroughput methods in prokaryotes. Despite this abundance, little is known about regulatory mechanisms and evolutionary aspects of these molecules, mainly in archaea, where the mechanism of double-strand RNA (dsRNA) degradation remains poorly understood. In this study, using dRNA-seq data, we identified 1626 antisense transcription start sites (aTSSs) in the genome of Halobacterium salinarum NRC-1, an important model organism for gene expression regulation studies in Archaea. By integrating gene expression data from 18 RNA-seq paired-end libraries, we were able to annotate 846 asRNAs from mapped aTSSs. We found asRNAs in ~21% of annotated genes including genes related to important characteristics of this organism, such as: gas vesicle proteins, bacteriorhodopsin, translation machinery and transposases. We also found asRNAs in type II toxin-antitoxin systems and using public dRNA-seq data, we show evidences that this phenomenon might be conserved in archaea and bacteria. The interaction of a ncRNA with its target may depend on intermediary proteins action. In archaea, the LSm protein is a RNA chaperone homologous to bacterial Hfq, involved in post-transcriptional regulation. We used RIP-seq data from RNAs immunoprecipitated with LSm and identified 91 asRNAs interacting with this protein, for 81 of these the mRNA of the sense gene is also interacting. We searched for aTSSs present in the same region of orthologous genes in the Haloferax volcanii. We found 160 aTSSs that originated asRNAs in H. salinarum NRC-1 that might be conserved in this two archaea. The expression of annotated asRNAs was analyzed over a growth curve and in a knockout strain for RNase R gene. We found 144 asRNA differentially expressed over the growth curve, for 56 of these the sense gene was also differentially expressed, characterizing possible cis regulators asRNAs. In the knockout strain we found five differentially expressed asRNAs and only one asRNA/gene pair, this result does not allow us to infer a dsRNA degradation in vivo activity for this RNase in H. salinarum NRC- 1. This work contributes to the discovery of the antisense transcriptome in H. salinarum NRC- 1 a relevant step to uncover the post-transcriptional gene regulatory network in this archaeon.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-15012019-101127 |
| Date | 04 September 2018 |
| Creators | João Paulo Pereira de Almeida |
| Contributors | Tie Koide, Angela Kaysel Cruz, Marilis do Valle Marques |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Bioquímica, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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