A deficiência de hormônio de crescimento (DGH) é tratada convencionalmente com repetidas injeções do hormônio recombinante. Este trabalho teve como objetivo estabelecer uma alternativa de tratamento baseada na transferência dos genes do hormônio de crescimento humano (hGH) ou de camundongo (mGH), em camundongos anões lit/lit ou lit/scid, mediante administração de DNA plasmidial associada à eletrotransferência, com a finalidade de atingir a máxima recuperação de crescimento em comparação ao camundongo normal (catch-up growth). Inicialmente foi realizada a administração do plasmídeo contendo o gene do mGH no músculo quadríceps exposto ou tibial anterior (TA) não exposto. Utilizando diferentes condições de eletrotransferência, baseadas em pulsos alternados de baixa (100 V/cm) e alta (1000 V/cm) voltagem (HV/LV, HV/8LV) ou em pulsos seguidos de baixa voltagem (8 pulsos de 150 V/cm), o músculo TA na condição HV/LV apresentou os maiores níveis de expressão de mGH: 6,7 ± 2,5 ng/mL. O tempo de exposição e a quantidade da enzima hialuronidase (HI) necessária para a eletrotransferência foram também analisados. O tempo de 30 minutos e a dose de 20 U de HI proporcionaram os melhores resultados de expressão. Diferentes quantidades de DNA foram também testadas, mas a administração de 50 μg DNA/animal foi confirmada como a melhor. Na padronização do volume de solução do plasmídeo administrado no TA, foi observado que a injeção de 20 μL de DNA apresentou expressão significativamente maior da proteína em comparação a de 10 μL. Buscando uma maior expressão de GH, foi realizado experimento adicionando poli-L-glutamato ao diluente do DNA, comparando também diferentes condições de eletrotransferência (HV/LV e 375 V/cm). A condição de 375 V/cm, sem a adição do polímero, proporcionou as maiores concentrações, tanto de hGH como de mGH, no soro de camundongos lit/scid e lit/lit, respectivamente. Quando utilizados 3 pulsos de 375 V/cm e a administração do plasmídeo com o gene do mGH em dois locais de cada músculo TA, foram obtidos os mais altos níveis de expressão atingindo 14,7 ± 3,7 ng mGH/mL. Estes foram os parâmetros utilizados em um bioensaio, no qual foi também determinada a medida do comprimento inicial e final do fêmur por radiografia. Neste bioensaio de 36 dias, a curva de crescimento dos camundongos lit/lit tratados foi similar a de camundongos heterozigotos não tratados e os níveis de mGH do grupo DNA foram significativamente maiores (P<0,0002) em relação ao grupo controle. Os camundongos tratados também apresentarem concentração de mIGF-I no soro superior a do grupo controle. Considerando os parâmetros de crescimento avaliados, o grupo tratado com DNA apresentou percentuais de incremento altamente significativos em relação ao grupo controle, com P<0,001 para o peso corpóreo e P<0,002 para o comprimento do corpo, da cauda e para ambos os fêmures, com valores de catch-up da ordem de 79% para o comprimento dos fêmures. Podemos concluir que foi estabelecida uma metodologia eficiente de transferência gênica não viral, que poderá levar a uma completa normalização de crescimento de camundongos anões mediante utilização de animais mais jovens, como mencionado na literatura e em trabalho recente do nosso grupo. / Growth hormone deficiency (GHD) is conventionally treated with repeated injections of the recombinant hormone. This work aimed at establishing an alternative treatment based on the transfer of the human (hGH) or mouse growth hormone (mGH) genes into lit/lit or lit/scid dwarf mice, using plasmid DNA administration associated with electrotransfer, in order to achieve the maximum growth recovery compared to normal mice (catch-up growth). Administration of the plasmid containing the mGH gene was first carried out in the exposed quadriceps or non-exposed anterior tibialis (TA) muscle. Using different electrotransfer conditions, based on alternate pulses of high (1000 V/cm) and low (100 V/cm) voltage (HV/LV, HV/8LV) or consecutive pulses of low voltage (8 pulses of 150 V/cm), the TA muscle in the HV/LV condition showed the highest levels of mGH expression: 6.7 ± 2.5 ng/mL. Exposure time and amount of the enzyme hyaluronidase (HI) required for electrotransfer were also analyzed. The time of 30 minutes and the dose of 20 U HI provided the best results of expression. Different amounts of DNA were also tested, but the administration of 50 μg DNA/animal was confirmed as the best. In the optimization of the volume of plasmid solution administered to TA, it was observed that injection of 20 μL of DNA showed a significantly higher expression of the protein compared with 10 μL. Aiming at a higher GH expression, an experiment was carried out by adding poly-L-glutamate to the DNA diluent, comparing also different electrotransfer conditions (HV/LV and 375 V/cm). The condition of 375 V/cm, without the polymer addition, provided the higher concentrations of both hGH and mGH in the serum of lit/scid or lit/lit mice, respectively. Using 3 pulses of 375 V/cm and administration of mGH-DNA in two locations on each TA muscle, the highest expression levels of up to 14.7 ± 3.7 ng mGH/mL were obtained. These were the parameters utilized in a bioassay, which was also carried out by measurement of the initial and final femur length by radiography. In this 36-day bioassay, the growth curve of treated lit/lit mice was similar to that of heterozygous untreated mice and the mGH levels of DNA group were significantly higher (P<0.0002) than the control group. Treated mice also showed a higher mIGF-I concentration in the serum compared to the control group. Concerning growth parameters, DNA-treated group showed percentages of increase highly significant compared to the control group, with P<0.001 for body weight and P<0.002 for body, tail and both femurs lengths, with catch-up values of the order of 79% for femur lengths. We can conclude that an efficient non-viral gene transfer methodology has been established, which lead to a complete growth normalization of the dwarf mice through the use of younger animals, as reported in the literature and in a recent paper of our group.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-29072016-145236 |
| Date | 24 June 2016 |
| Creators | Lima Filha, Eliana Rosa |
| Contributors | Peroni, Cibele Nunes |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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