Zusammenfassung Thema dieser Arbeit sind zwei zentrale biochemische Aspekte der Proteinbiosynthese , wobei das Ribosom eine zentrale Komponente darstellt: erstens wird ein spezieller Faktor des Elongationszyklus in Pilzen, eEF3, und zweitens der proteinleitende Kanal bei der kotranslationalen Proteintranslokation durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) betrachtet. Für die Elongation der Polypeptidkette benötigen alle Organismen zwei Elongationsfaktoren, die GTPasen eEF1A (EF-Tu in Prokaryoten) und eEF2 (EF-G in Prokaryoten). Bei Fungi wird noch ein dritter Elongationsfaktor, eEF3, benötigt. Dieser Faktor ist eine ATPase mit ABC-Kassetten-Domänen. Durch einen nicht bekannten Mechamismus stimuliert er in Gegenwart von ATP die eEF1A-abhängige Bindung von Aminoacyl-tRNA an die ribosomale A-Stelle. Es wurde vorgeschlagen, dass eEF3 die Freisetzung von deacylierter tRNA aus der ribosomalen E-Stelle ermöglicht, und dadurch über allosterische Kopplung die Affinität der A-Stelle für Aminoacyl-tRNA erhöht. In dieser Arbeit wird die Kryo-EM Struktur von ribosomengebundenem eEF3 bei 13,3 Å vorgestellt. Dabei zeigt sich eine vollig neue ribosomale Bindungsstelle für eEF3 von der aus tatsächlich die Affinität für tRNA in der ribosomalen E-Stelle moduliert werden kann. Mit Hilfe der Kristallstruktur von eEF3 wurde ein molekulares Modell für eEF3 in seiner funktionalen Konformation generiert, welches die strukturelle Basis für die Aktivität dieses ABC-Proteins im Kontext der Translation liefert. Bei der kotranslationalen Translokation stellt der heterotrimere Sec61-Komplex einen signalsequenzgesteuerten proteinleitenden Kanal (PCC) dar, der die Translokation eines sekretorischen Proteins durch, oder die Integration von Membranproteinen in die ER-Membran erlaubt. Es wird angenommen, dass der aktive proteinleitende Kanal im ribosomengebundenen Zustand aus einer oligomeren Struktur mit mehreren Kopien des Sec61-Heterotrimers besteht. Die Kristallstruktur eines inaktiven PCC zeigt jedoch nur ein einziges Heterotrimer (Monomer), das auch im aktiven Zustand funktional sein könnte. In dieser Arbeit wird eine Kryo-EM-Struktur des aktiven proteinleitenden Kanals im Komplex mit einem translatierenden Ribosom aus Hefe präsentiert, die die bislang detailierteste Elektronendichtekarte für den PCC zeigt. Als charakteristisches Merkmal kann eine trichterförmige Pore auf der zytosolischen Seite visualisiert werden. Es wurden verschiedene molekulare Modelle für den aktiven Zustand in die Elektronendichte gedockt. Obwohl eine genaue molekulare Interpretation durch die Auflösung (12,3 Å) nach wie vor limitiert ist, erscheint es sehr wahrscheinlich, dass nur ein einziges, geöffnetes Sec61-Heterotrimer im aktiven Kanal vorliegt. / This work presents cryo-EM structures of two active ribosomal ligands in yeast, namely eEF3 and Sec61. Protein synthesis requires two canonical elongation factors in all kingdoms. These are the GTPases eEF1A (EF-Tu in prokaryotes) and eEF2 (EF-G in prokayotes). In fungi, a third elongation factor eEF3 is required, which belongs to the ATP-binding cassette- (ABC-) protein family. This factor is essential for the binding of the aminoacyl-tRNA-eEF1A-GTP ternary complex to the A site of the ribosome and has been suggested to do so by facilitating the clearance of deacyl-tRNA from the ribosomal E-site. The cryo-EM structure of the ATP-bound form of eEF3 in complex with an 80S ribosome shows that eEF3 binds the ribosome in the post-translocational conformation using a novel binding site. From there the affinity for tRNA in the ribosomal E site could be easily modified. Using the crystal structure of eEF3, a molecular model for eEF3 was generated, which provides the structural basis for the activity of an ABC protein in the context of translation. In co-translational translocation the trimeric Sec61-complex serves as a signal sequence-gated protein-conducting channel (PCC) which allows the translocation of a secetory protein through and the integration of a membrane protein into the lipid bilayer of the ER. Bound to a ribosome, the active PCC seems to have an oligomeric structure consisting of several copies of Sec61-trimers. The crystal structure of an inactive PCC, however, shows only a single heterotrimer (monomer) which could also be functional in the active state. The cryo-EM structure of the active PCC in complex with a translating ribosome shows the hitherto most detailed electron density map for the PCC. The most characteristic feature is a funnel-shaped off-centered pore at the cytosolic side. Several models for the active state were docked into the EM-density. Although a precise molecular interpretation is limited by the resolution (12, 3 Å), a single copy of an opened Sec61-heterotrimer seems to be the most reasonable fit for the density.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/16273 |
| Date | 30 January 2007 |
| Creators | Becker, Thomas |
| Contributors | Herrmann, A., Hoffmann, K. P., Spahn, C. |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
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