Se purificó la enzima L-aminoácido oxidasa (LAO) del veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox “Jergón” y se determinaron sus propiedades cinéticas. La LAO fue purificada mediante dos pasos cromatográficos, una columna de filtración molecular empleando Sephadex G-75 y otra de intercambio catiónico con CM-Sephadex C-50. La enzima tuvo un peso molecular de 54.6 kDa calculado por PAGE-SDS. Entre los sustratos ensayados a pH 8.5, la LAO presentó mayor actividad específica sobre L-fenilalanina, y luego sobre L-leucina, L-metionina y L-arginina, estando su actividad máxima en un rango de pH de 6.9 a 9.6. Para cada sustrato se determinaron los valores de pH óptimo obteniéndose 8.1 con L-metionina, 8.9 con L-arginina, y 8.2 con L-fenilalanina. Para estos aminoácidos, se determinaron los parámetros cinéticos de Km, Vmax, Kcat y Kcat/Km a pH 7.5 y 8.5. De acuerdo a la eficiencia catalítica, la L-leucina fue el mejor sustrato a pH 8.5 (Kcat/km igual a 71.213 x 104 s-1 M-1) y a 7.5 (Kcat/km igual a 40.903 x 104 s-1 M-1). Asimismo se evaluó la inhibición enzimática a pH 8.5 utilizando ácido antranílico, ácido benzoico, ácido salicílico y ácido sulfanílico, determinándose el modelo de inhibición y los valores de Ki. Se encontró que el ácido antranílico tuvo el menor valor de Ki (0.0082 mM), ajustándose al modelo de inhibición no competitiva, el ácido benzoico fue considerado un inhibidor competitivo y los ácidos salicílico y sulfanílico fueron inhibidores de tipo mixto. / An L-amino acid oxidase from Bothrops atrox venom was purified and its kinetic properties determinated. Purification procedure was carried out through two chromatography steps: a size exclusion chromatography on Sephadex G-75, followed by an ion exchange chromatography on CM-Sephadex C-50. This enzyme had a molecular weight of 54.6 kDa calculated by SDS-PAGE. Between substrates assayed to pH 8.5, LAO had higher specific activity on L-phenilalanine followed by L-leucine, L-metionine and L-arginine. These were in a range of pH 6.9 to 9.6 being optimum values of 8.1 for L-metionine, 8.9 for L-arginine, and 8.2 for L-fenilalanine. Kinetics parameters (Km, Vmax, Kcat and Kcat/Km) for these L-amino acids were determinated at pH 7.5 and 8.5. According to catalytic efficiency, we found that L-leucine was the best substrate at pH 7.5 (Kcat/km same to 40.903 x 104 s-1 M-1) and 8.5 (Kcat/km same to 71.213 x 104 s-1 M-1). By the way, we evaluated enzyme inhibition at pH 8.5 using anthranilic, benzoic, salicylic and sulphanylic acid, determinating the best model of enzyme inhibition as well as Ki values. The minimal Ki value was for anthranilic acid Ki (0.0082 mM), fitting it to a non-competitive model. Benzoic acid was considered a competitive inhibitor, while salicylic and sulphanylic acid showed mixed-type inhibition.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:Cybertesis/sdx:www.cybertesis.edu.pe:80:sisbib/documents/sisbib.2009.ruiz_gn-principal |
| Date | January 2009 |
| Creators | Ruiz Guevara, Nora Cecilia |
| Publisher | Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Programa Cybertesis PERÚ |
| Source Sets | Universidad Nacional Mayor de San Marcos - SISBIB PERU |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Format | text/xml |
| Rights | Ruiz Guevara, Nora Cecilia, norisruiz@gmail.com |
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