L’objectif du projet est de comprendre l’effet du peptide vecteur (R/W)9 sur les cellules tumorales EF, modèles du sarcome d’Ewing. En effet, ce peptide a la capacité de remodeler le cytosquelette d’actine dans ces cellules, ainsi que de réduire leur motilité et leur aptitude à croître en indépendance d’ancrage (Delaroche D. JBC 2010).La première étape de ce travail a été la caractérisation in vitro de l’interaction directe avec l’actine par cross-linking chimique et spectrométrie de masse (Clavier S. EuProt 2014). Ensuite, pour avancer dans la compréhension de l’effet du peptide (R/W)9, deux approches ont été développées.La première approche, basée sur du photocross-linking in cellulo ou in lysat, vise à identifier des partenaires intracellulaires du peptide vecteur. Pour cela, nous avons mis au point et validé biologiquement une version photoactivable du peptide (R/W)9. Puis, avant de passer sur cellules entières, nous nous sommes assurés de la faisabilité de la réaction de photocross-linking in vitro sur un système d’interaction modèle que nous avons également utilisé pour développer un logiciel capable d’interpréter les spectres MS/MS d’espèces photocross-linkées (Xlink-Identifier, Collaboration Dr Du X). Des expériences de purification d’affinité ont également été menées en immobilisant le peptide (R/W)9 sur des billes de streptavidine ensuite mises en présence de lysat cellulaire. Les protéines capturées ont été identifiées par spectrométrie de masse haut-débit. La seconde approche est de la protéomique différentielle avec un marquage SILAC et a pour objectif de mettre en évidence l’influence du peptide vecteur sur l’expression des protéines. / The aim of the project is to understand the effect of (R/W)9 cell penetrating peptide (CPP) on EF tumoral cells, an Ewing sarcoma model cell line. Actually, this peptide is able to remodel the actin cytoskeleton of these cells, to decrease their motility as well as their ability to grow without anchorage (Delaroche D. JBC 2010).The first step of this work was to characterize the in vitro interaction with actin using chemical cross-linking and mass spectrometry (Clavier S. Euprot 2014). Then, in order to get a deeper understanding of (R/W)9 peptide effect, two approaches were developed. The goal of the first approach based on in cellulo or in lysate photocross-linking is to identify (R/W)9 CPP’s partners. To do this, we designed and biologically validated a photoactivable version of (R/W)9 peptide. Then, before starting to work with living cells, we checked the feasibility of in vitro photocross-linking on a model interacting system that we also used to develop a software able to interpret MS/MS spectra of photocross-linked species. (Xlink-Identifier, Collaboration with Dr. X. Du.). Affinity purification experiments were also performed by incubating streptavidin magnetic beads bearing (R/W)9 peptide with cell lysates. Captured proteins were identified using high-throughput mass spectrometry. The second approach is differential proteomic with SILAC labelling and aims at assessing the influence of (R/W)9 CPP on proteins expression.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2014PA066308 |
| Date | 16 October 2014 |
| Creators | Clavier, Severine |
| Contributors | Paris 6, Bolbach, Gérard, Sachon, Emmanuelle |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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