Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2007. / Submitted by Luanna Maia (luanna@bce.unb.br) on 2009-03-09T12:48:41Z
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Tese_Loiselene Carvalho da Trindade.pdf: 3690145 bytes, checksum: 0c6bb1644820c1ea99648a03adf90c94 (MD5) / A bactéria Xanthomonas campestris pv. viticola (Nayudu) Dye, agente do cancro
bacteriano da videira, foi relatada pela primeira vez nas áreas irrigadas do Submédio do
Vale São Francisco em Petrolina, Pernambuco, em 1998. A doença também foi
identificada em Juazeiro, Bahia, e posteriormente no Piauí, no Ceará, Roraima e Goiás. O
uso de material propagativo livre do patógeno tornou-se uma preocupação, uma vez que a
ocorrência da bacteriose ainda esta restrita a essas regiões no país e existe o risco de
disseminação para outras regiões produtoras no sul e sudeste do Brasil.
Com o objetivo de desenvolver um método molecular para detecção e identificação
dessa bactéria, três oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados com base no
seqüenciamento parcial do gene hrpB. As combinações de iniciadores Xcv1F/Xcv3R e
RST2/Xcv3R foram testados quanto à especificidade e sensibilidade para detecção do
DNA de X. campestris pv. viticola. Com os dois pares de iniciadores, a amplificação foi
positiva com o DNA das 44 estirpes de X. campestris pv. viticola testados, com quatro
estirpes da patovar mangiferaeindicae, e cinco estirpes de X. axonopodis pv. passiflorae.
Contudo, a digestão dos produtos de PCR com HaeIII permitiu diferenciar as estirpes das
três patovares. Nenhum dos dois pares de iniciadores amplificou o DNA de videira, de 20
bactérias não patogênicas da flora da videira, e de nove estirpes de outros sete gêneros de
bactérias fitopatogênicas. A sensibilidade dos iniciadores Xcv1F/Xcv3R e RST2/Xcv3R
foi de 10 pg e 1 pg de DNA purificado de X. campestris pv. viticola, respectivamente. O
limiar de detecção de RST2/Xcv3R foi de 104
UFC/ml, mas empregando-se um segundo
ciclo de amplificação com o iniciador interno Xcv1F, esse limiar foi reduzido para 102
UFC/ml.
Os iniciadores foram testados na detecção da bactéria em pecíolos inoculados com
a estirpe UnB 1186 e embora não se tenha tido sucesso na PCR com o extrato do macerado
do tecido sintomático, foi possível detectar o patógeno usando-se lavado de placas após o
crescimento por 72 h ou a partir de uma única colônia diluída em 200 l de água. A
identidade da bactéria foi confirmada pela análise de RFLP, que gerou o padrão típico de
X. campestris pv. viticola.
Com o uso de nested-BIO-PCR utilizando dois ciclos de amplificação com os
iniciadores RST2/Xcv3R e Xcv1F/Xcv3R foi possível detectar X. campestris pv. viticola
em plantas assintomáticas e sintomáticas, coletadas em março de 2007, em Petrolina, PE.
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Este método mostrou-se mais eficiente que a detecção direta, ou seja, sem uma etapa de
enriquecimento em meio de cultura. Além disso, foi possível reduzir para 72 horas o tempo
para detecção e identificação de X. campestris pv. viticola, tempo reduzido se comparado
aos métodos convencionais.
A alta similaridade observada entre as duas patovares, viticola e mangiferaeindicae
de X. campestris foi comprovada através da análise de seqüências de nucleotídeos de
diferentes regiões genômicas, ITS, 16S rRNA, hrpB6 e o gene do citocromo “b561-like”.
Os resultados também sugeriram que as duas patovares estariam mais próximas
filogeneticamente a X. campestris e X. axonopodis. Testes de inoculação cruzada em
videira e mangueira mostraram a capacidade de X. campestris pv. mangiferaeindicae de
infectar plantas de videira e confirmaram a patogenicidade de X. campestris pv. viticola à
mangueira, quando a inoculação é feita por infiltração foliar. O estudo dos perfis
plasmideais mostrou variabilidade entre as estirpes em relação ao número e tamanho dos
plasmídeos, sendo o primeiro relato da presença de plasmídeos em X. campestris pv.
viticola. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The bacterium Xanthomonas campestris pv. viticola (Nayudu) Dye, causal agent of
grapevine bacterial canker, was first detected in Brazil in the irrigated areas of the São
Francisco river basin, in Petrolina, State of Pernambuco, in 1998. The disease was also
reported in Juazeiro, Bahia and later in the states of Piauí, Ceará, Roraima and Goiás. The
use of pathogen-free propagative material has become an important concern, considering
the restricted occurrence of this pathogen in the country and the risk of dissemination to
other grapevine production regions in the south and southeast of the country.
In order to develop a molecular method for detection and identification of this
pathogen, three primers were designed based on the partial sequences of the hrpB gene.
The primers combinations Xcv1F/Xcv3R and RST2/Xcv3R were tested for specificity and
sensitivity in detecting X. campestris pv. viticola DNA. With the two sets of primers,
amplification was positive with all 44 X. campestris pv. viticola isolates tested, 4 isolates
of pathovar mangiferaeindicae and 5 of X. axonopodis pv. passiflorae. Digestion of PCR
products with HaeIII allowed differentiation of these 3 pathovars. None of the primer pairs
were able to amplify grapevine DNA, DNA from 20 non pathogenic bacterium from the
grapevine microflora, or DNA from 9 isolates from 7 genera of plant pathogenic bacteria.
Sensitivity of the primers Xcv1F/Xcv3R and RST2/Xcv3R was 10 pg and 1 pg of purified
X. campestris pv. viticola DNA, respectively. The detection limit for RST2/Xcv3R was 104
UFC/ml, but this limit could be lowered to 102
CFU/ml with a second round of
amplification using the internal primer Xcv1F.
The primers were tested for detecting of X. campestris pv. viticola in grapevine
petioles previously inoculated with strain UnB 1186, and although amplification was not
possible using extracts of macerated plant tissue, detection was possible using agar plate
washes after 72 h of growth, or from a single colony diluted in 200 l of water.
Using Nested-BIO-PCR with two amplification rounds with RST2/Xcv3R and
Xcv1F/Xcv3R primers, it was possible to detect X. campestris pv. viticola in both
symptomatic and asymptomatic plants. This method was more effective than a method that
employed direct detection from boiled macerated extracts with no previous enrichment on
culture medium. The use of BIO-PCR reduced the time needed for detecting and
identifying X. campestris pv. viticola to 72 hours, when compared to more traditional
diagnostic methods.
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The high similarity observed between the two pathovars of X. campestris, viticola
and mangiferaeindicae was cnfirmed by the analysis of nucleotide sequences from
different genomic regions, ITS, 16S rRNA, hrpB6 and the cytochrome b561-like gene. The
results also suggested that these two pathovars are phylogenetically related to X.
campestris and X. axonopodis. Cross inoculation tests on grapevine and mango plants
inoculation, showed the ability of X. campestris pv. mangiferaeindicae to infect grapevine
and confirmed the pathogenicity of X. campestris pv. viticola to mango plants, when using
the infiltration technique. Plasmid DNA extractions showed variability among strains of
the two pathovars in plasmid number and size. This is the first report of plasmid
occurrence in X. campestris pv. viticola.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/1456 |
| Date | January 2007 |
| Creators | Trindade, Loiselene Carvalho da |
| Contributors | Ferreira, Marisa Alvares da Silva Velloso |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | Free, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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