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Previous issue date: 2009-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Begomoviruses belong to the Geminiviridae family which includes viruses with genomes containing one or two single stranded DNA molecules within icosahedral geminate particles. Begomoviruses are transmitted by the whitefly Bemisia tabaci and may cause diseases of economical importance in several crops mainly in tropical and subtropical regions. In Brazil there are several reports of begomovirus causing serious losses to the common bean and tomato crops, and sporadic reports of infection of soybean. Virus-induced gene silencing (VIGS) is an attractive and fast alternative for studying the expression and function of genes because it does not require plant transformation. Viruses with RNA or DNA genomes have been successfully used as vectors to induce gene silencing in plants. However, there are few examples of efficient vectors for inoculation of tomato and soybean. The main goal of this work was to build a viral vector based on the DNA-A of the begomovirus Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) to induce gene silencing in plants of soybean, tomato and Nicotiana benthamiana. The viral vector, designated pToR-A1.4ΔCP, was built from an infectious ToRMV-A clone from which the gene encoding the capsid protein was removed and replaced by the multiple cloning site of the plasmid vector pBluescript KS+ (pKS+). Like other begomoviruses, ToRMV does not require the capsid protein to cause a systemic infection. The construction of the viral vector was confirmed by PCR, enzymatic cleavage and DNA sequencing. To be used on gene silencing experiments, fragments from the following genes were PCR amplified from cDNA clones: phytoene desaturase (PDS) from soybean and tomato, myo-inositol-1-phosphate synthase (MIPS) from soybean and stachyose synthase (STS) from soybean. All fragments were amplified with primers contained restriction sites for cloning. After amplification, the fragments were cloned in pGEM-T Easy vector, sequenced and aligned to the corresponding cDNAs to confirm their identity. To clone these fragments in the viral vector they were cleaved out of the pGEM-T Easy vector, purified and cloned into the pToR-A1.4ΔCP vector previously cleaved at the multiple cloning site with the same enzymes used to cleave the plasmid vector. The ligation reaction used T4 DNA ligase and ultracompetent Escherichia coli cells were transformed by heat shock. Transformants colonies were analyzed by PCR and enzymatic cleaved. Systemic infection of soybean, tomato and Nicotiana benthamiana plants with the empty pToR-A1.4ΔCP vector co-inoculated with ToRMV DNA-B was checked by PCR 21 days after inoculation. In the case of N. benthamiana, the viral vector presented 82% infectivity, indicating the high potential of this vector for VIGS studies in this plant species. In the case of soybean and tomato, the viral vector presented low replication efficiency. New infectivity tests need to be done to confirm these results. It is expected that this viral vector will represent an alternative for functional genomic studies and for the analysis of genes involved in several biological processes. / Os begomovírus pertencem à família Geminiviridae, que inclui vírus com genoma composto por uma ou duas moléculas de DNA circular de fita simples, encapsidado em partículas icosaédricas geminadas. Os begomovírus são transmitidos pela mosca branca Bemisia tabaci e causam doenças de importância econômica em diversas culturas, principalmente em regiões tropicais e subtropicais. No Brasil, há diversos relatos de begomovírus causando sérias perdas nas culturas do feijoeiro e tomateiro e relatos esporádicos de incidência na cultura da soja. O silenciamento gênico induzido por vírus (VIGS) é uma alternativa atraente e rápida para o estudo da expressão e função de genes, pois não há necessidade de transformação genética da planta. Vírus com genoma de RNA e de DNA têm sido utilizados com sucesso como vetores para indução de silenciamento gênico em plantas. Entretanto, existem poucos vetores eficientes para a inoculação em plantas de tomate e de soja. O objetivo deste trabalho foi a construção de um vetor viral, baseado no DNA-A do begomovírus Tomato rugose mosaic virus (ToRMV), para a indução do silenciamento de genes em plantas de soja, tomate e Nicotiana benthamiana. O vetor viral, denominado pToR-A1.4ΔCP, foi construído a partir de um clone infeccioso do ToRMV-A do qual foi removido o gene da proteína capsidial, substituindo pelo sítio múltiplo de clonagem do vetor pBluescript KS+ (pKS+). Assim como outros begomovírus, o ToRMV não requer a proteína capsidial para causar infecção sistêmica. A construção do vetor viral foi confirmada por PCR, clivagem enzimática e sequenciamento. Para serem utilizados em experimentos de silenciamento gênico, fragmentos referentes aos genes fitoeno dessaturase (PDS) de soja e tomate, myo-inositol- 1-fosfato sintase (MIPS) de soja e estaquiose sintase (STS) de soja foram isolados a partir de cDNA dessas plantas, utilizando primers específicos, contendo sítios de restrição adequados para as clonagens. Após a amplificação, todos os fragmentos obtidos foram clonados em pGEM-T Easy, sequenciados e sua identificação foi confirmada por meio de alinhamento utilizando o algoritmo BLASTn. Para a clonagem no vetor viral, os fragmentos foram liberados do vetor pGEM-T Easy com as enzimas de restrição adequadas, purificados e inseridos no vetor pToR-A1.4ΔCP, previamente clivado em seu sítio múltiplo de clonagem com as mesmas enzimas. A reação de ligação foi realizada utilizando T4 DNA ligase e células de Escherichia coli ultracompetentes foram transformadas por meio de choque térmico. Os transformantes foram analisados por PCR e reação de clivagem enzimática. A infecção sistêmica de plantas de soja, tomate e Nicotiana benthamiana pelo vetor pToR-A1.4ΔCP vazio, inoculado conjuntamente com o DNA-B do ToRMV, foi diagnosticada via PCR aos 21 dias após a inoculação. Em N. benthamiana, o vetor viral apresentou 82% de infectividade, indicando um grande potencial de uso em estudos de VIGS nessa planta. Já em plantas de soja e tomate, o vetor viral apresentou baixa taxa de replicação. Portanto, novo teste de infectividade deve ser realizado para confirmar os resultados obtidos. Dessa forma, espera-se que este vetor viral sirva como um complemento e uma alternativa em estudos de genômica funcional e na análise de genes envolvidos em vários processos biológicos.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/4685 |
| Date | 20 February 2009 |
| Creators | Cardoso, Mariana Santos |
| Contributors | Zerbini Júnior, Francisco Murilo, Marcelino, Francismar Corrêa, Barros, Everaldo Gonçalves de, Guimarães, Valéria Monteze, Fietto, Luciano Gomes |
| Publisher | Universidade Federal de Viçosa, Mestrado em Genética e Melhoramento, UFV, BR, Genética animal; Genética molecular e de microrganismos; Genética quantitativa; Genética vegetal; Me |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFV, instname:Universidade Federal de Viçosa, instacron:UFV |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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