Los viroides, los agentes infecciosos más simples de la escala biológica, están constituidos por
una molécula circular de RNA monocatenario de aproximadamente 250-400 nucleótios (nt) que no
codifica proteína alguna. A pesar de esta simplicidad estructural, los viroides son capaces de
replicarse autónomamente, moverse sistémicamente y en muchos casos causar enfermedades en
sus plantas huéspedes. Las infecciones producidas por viroides representativos generan la
acumulación de pequeños RNAs viroidales (vd-sRNAs) de 21-24 nt con características similares a
los pequeños RNA interferentes (siRNAs), la huella dactilar del silenciamiento mediado por RNA.
La identificación de los vd-sRNAs implica que los viroides son diana de la primera barrera de
silenciamiento mediado por RNA, formada por las RNasas ‘Dicer-like’ (DCLs). Para examinar si
los vd-sRNAs se unen a las proteínas AGOs —el componente clave del complejo RISC (‘RNAinduced
silencing complex’) que constituye la segunda barrera del silenciamiento mediado por
RNA— hojas de Nicotiana benthamiana infectadas por el viroide del tubérculo fusiforme de la
patata (PSTVd) se agroinfiltraron con nueve de las diez proteínas AGOs de Arabidopsis thaliana.
Inmunoprecipitaciones a partir de los halos agroinfiltrados y análisis ‘Western-’ y ‘Northern-blot’
han mostrado que todas las AGOs se expresaron y, a excepción de AGO6, AGO7 y AGO10,
unieron vd-sRNAs: AGO1, AGO2 y AGO3 los de 21 y 22 nt, mientras que AGO4, AGO5 y AGO9
también mostraron afinidad por los de 24 nt. La secuenciación masiva mostró que las AGO1,
AGO2, AGO4 y AGO5 agroexpresadas unen los PSTVd-sRNAs en función de su tamaño y
nucleótido 5’-terminal, y que los perfiles de los correspondientes vd-sRNAs cargados en las AGOs
adoptan una distribución específica a lo largo del genoma viroidal. La agroexpresión de AGO1,
AGO2, AGO4 y AGO5 en hojas de N. benthamiana infectadas con PSTVd atenuó la acumulación
de los RNAs genómico viroidales, indicando que éstos, o sus precursores, también son diana de
RISC. En contraste con los ribovirus, la infección de PSTVd en N. benthamiana no afectó de forma
significativa la regulación mediada por miR168 de la AGO1 endógena, que carga vd-sRNAs con
especificidad similar a su homóloga de A. thaliana.
Mientras se conoce bien la biogénesis de los RNA viroidales, su degradación está restringida a
algunos datos que implican al silenciamiento mediado por RNA. En el curso de nuestros estudios
sobre el PSTVd, hemos observado consistentemente un patrón de 6-7 RNAs subgénomicos
(sgRNAs) de polaridad (+) que aparecen junto con los RNAs monoméricos circulares y lineares en
berenjena, un huésped experimental de este viroide. Hibridaciones ‘Northern-blot’ con sondas de
tamaño parcial y completo, mostraron que los sgRNAs (+) de PSTVd derivan de diferentes
regiones del RNA genómico y que algunos son parcialmente solapantes. Parte de los sgRNAs (+)
de PSTVd se observaron también en N. benthamiana y tomate, donde han pasado desapercibidos a
causa de su menor acumulación. El análisis por extensión de cebador de sgRNAs (+) de PSTVd
representativos excluye que sean productos de terminaciones prematuras de la transcripción, pues
carecen del extremo 5’ común que cabría esperar si ésta empezara en una posición específica.
Ulteriores análisis mediante 5’- y 3’-RACE indican que los sgRNAs (+) de PSTVd tienen extremos
5’-OH y 3’-P, que probablemente resultan de cortes endonucleolíticos de precursores más largos
catalizados por RNasas típicas que generan este tipo de extremos. Análisis de sgRNA (-) de
PSTVd, que también se acumulan en berenjena infectada, mostraron que presentan características
estructurales muy similares a los sgRNA (+). Nuestros resultados proporcionan una nueva visión
de cómo ocurre la degradación in vivo de los RNAs viroidales, posiblemente durante su replicación,
y sugieren que síntesis y degradación de las cadenas de PSTVd están conectadas, como se ha
observado en los mRNAs. / Minoia, S. (2015). Degradación in vivo de un viroide de replicación nuclear: rutas catalizadas por proteínas Argonauta cargadas con pequeños RNAs viroidales y por otras ribonucleasas que generan RNAs subgenómicos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48553 / TESIS
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upv.es/oai:riunet.upv.es:10251/48553 |
| Date | 31 March 2015 |
| Creators | Minoia, Sofia |
| Contributors | Di Serio, Francesco, Flores Pedauye, Ricardo, Navarro Ramirez, Beatríz, Universitat Politècnica de València. Departamento de Biotecnología - Departament de Biotecnologia |
| Publisher | Universitat Politècnica de València |
| Source Sets | Universitat Politècnica de València |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/acceptedVersion |
| Rights | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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