Metapneumovírus Aviário (aMPV), família Pneumoviridae, gênero Metapneumovírus, é o agente etiológico responsável pela rinotraqueíte dos perus e também está associada à síndrome da cabeça Inchada em galinhas, duas importantes doenças respiratórias que acometem aves comerciais e levam a grandes perdas econômicas. O objetivo deste estudo foi detectar a presença de aMPV em amostras de aves silvestres e realizar a caracterização molecular dos isolados encontrados, com o intuito maior de contribuir para o entendimento da epidemiologia desse vírus. Para isso foram coletados no total, 448 suabes orofaringeanos (OP) e cloacais (C) oriundos de 234 aves silvestres em quatro locais do estado de São Paulo. Três tipos de amostras foram processadas e testadas: 1) 266 suabes agrupados de um ou até cinco animais que estavam no mesmo recinto e respeitando o mesmo tipo de suabe (OP ou C); 2)188 suabes foram agrupados na forma de pools de até dois animais, contendo os suabes OP e C de cada animal, formando então 48 pools; 3) amostras de tecido traqueal e pulmonar de três Egretta thula também foram coletados e testados. A purificação de RNA viral foi realizada utilizando o QIAmp RNA Mini Kit Kit (Qiagen). Para o teste de RT-PCR foi utilizado o kit OneStep RT-PCR (Qiagen) com primers baseados no gene N, previamente descritos, com fragmento esperado de 115 bp. As amostras foram também testadas por RT-PCR em tempo real (RRT-PCR) com primers específicos previamente descritos, para os subtipos A e B, com base no gene G com fragmentos de 116 e 135 bp, respectivamente. Os fragmentos das amostras positivas foram purificados e sequenciados pelo sequenciamento tipo Sanger para caracterização por análises filogenéticas. Das 126 amostras testadas pelo teste de RT-PCR baseado no gene N, quatorze foram positivas: oito amostras de Anseriformes (Aix sponsa, Aix galericulata, Dendrocygna viduata), três de Columbiformes (Columba livia), um de Falconiformes (Falco sparverius), um de Psittaciformes (Psittacara leucophthalma) e um de Pelecaniformes (Egretta thula). Das quatorze amostras positivas, treze eram provenientes de suabes, e a décima quarta era oriunda de tecido traqueal de Egretta thula. Pelo teste de RRT-PCR baseado no gene G nenhuma das 184 amostras testadas foi positiva. As análises filogenéticas realizadas com fragmentos de 44 e 54 bp do gene N de duas amostras positivas, que se agruparam com isolados pertencentes ao aMPV de subtipo A. Estes vírus apresentaram alta identidade com as estirpes derivadas de vacina e com estirpes vacinais, o que mostra uma possível ocorrência de escapes vacinais de aves de produção para as aves silvestres. / Avian metapneumovirus (aMPV), family Pneumoviridae, genus Metapneumovirus, it is the etiologic agent responsible for turkey rhinotracheitis and is also associated with swollen head syndrome in chickens, two important respiratory diseases in poultry which leads to large economic losses. The aim of this study was detect the presence of aMPV in wild birds samples, to perform the phylogenetic analysis of the isolates found with the major objective of contributing to the understanding of the epidemiology of this virus in poultry farms. In total, 448 oropharyngeal (OP) and cloacal (C) swabs from 234 wild birds collected in four different locations within the state of São Paulo. The samples were processed and tested in three different ways: 1) 266 swabs were in the form of pools of one up to five animals that were in the same enclosure and respecting the same type of swab (OP or C); 2) 188 remaining swabs were grouped into pools of up to two animals, containing the oropharyngeal and cloacal swabs of each animal; 3) tracheal and pulmonary tissue samples were also collected and tested. Purification was performed using the QIAmp RNA Mini Kit Kit (Qiagen). Viral detection was performed by conventional RT-PCR technique using the OneStep RT-PCR kit (Qiagen) with primers based on the N gene, previously described with expected fragment of 115 bp. The samples were also tested by a real time RT-PCR (RRT-PCR) with specific primers previously described, for subtypes A and B, based on the G gene with fragments of 116 and 135 bp, respectively. Of the 126 samples tested by the RT-PCR N gene based, fourteen were positive: eight samples of Anseriformes (Aix sponsa, Aix galericulata, Dendrocygna viduata), three Columbiformes (Columba livia), one Falconiformes (Falco sparverius), one Psittaciformes (Psittacara leucophtalma) and one Pelecaniformes (Egretta thula). Of the swab samples, five were derived from oropharyngeal swabs and four from cloacal swabs, the other four samples were detected in the samples processed in pools of up to two animals, which contained the oropharyngeal and cloacal swabs of each bird. The positive Egretta thula sample was from a tracheal tissue sample. Based on the RRT-PCR G gene based, none of the 184 samples tested were detected. Phylogenetic analyzes were performed on two positive samples that proved to belong to aMPV subtype A, showing high similarity with the strains derived from the vaccine and with vaccine strains.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-17052017-125020 |
| Date | 10 March 2017 |
| Creators | Rizotto, Laís Santos |
| Contributors | Ferreira, Helena Lage |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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