Tesis para optar al grado de Doctor en Química / Las enzimas son capaces de acelerar reacciones químicas con una gran selectividad,
permitiendo que la vida sea posible como la conocemos. Glutamato mutasa (GM) es una enzima
dependiente de adenosilcobalamina (AdoCbl), la cual cataliza la isomerización reversible de
glutamato (glm) a metilaspartato (masp). AdoCbl es un cofactor que consiste en un macrociclo
ubicado en el plano ecuatorial denominado corrina, el cual tiene como átomo central un Co+3.
Este metal está axialmente coordinado por un ligando desoxiadenosina e intramolecularmente
por un grupo 5,6-dimetilbenzimidazol. El mecanismo propuesto para la reacción de
isomerización comienza con la unión del sustrato al sitio catalítico, la cual induce la ruptura
homolítica del enlace cobalto-carbono (Co-C) del cofactor. Como producto de esta disociación
homolítica se forma el radical desoxiadenosilo (Ado•) que luego abstrae un hidrógeno desde el
sustrato, formando un radical derivado del sustrato y AdoH. Este radical sufre un
reordenamiento que da origen al radical relacionado con el producto, el cual reabstrae el
hidrógeno desde AdoH, regenerando Ado•. El ciclo catalítico termina con la formación del
enlace Co-C. La generación de intermediarios radicalarios altamente reactivos hace que esta
reacción sea muy difícil de llevar a cabo sin reacciones secundarias. Es así que la necesidad de
una maquinaria catalítica capaz de controlar los caminos de reacción sea indispensable.
Una interesante pregunta en química bioinorgánica es cómo luego de la unión del sustrato, el
complejo cofactor-enzima es capaz de modificar su estructura electrónica debilitando el enlace
Co-C hasta su disociación homolítica. Además, el camino de reacción exacto que conecta el
rompimiento del enlace Co-C con el proceso de abstracción del hidrógeno desde el sustrato
permanece incierto. Finalmente, el papel exacto que cumple el entorno enzimático en el
mecanismo de isomerización está lejos de ser completamente comprendido. La necesidad de una
mayor comprensión del mecanismo catalítico de GM, especialmente el proceso de control de la
ruptura del enlace Co-C y el mecanismo para controlar la transformación química catalizada por
GM son interesantes problemas para ser resueltos por métodos químico computacionales.
En este trabajo presentamos un conjunto de modelos químico-cuánticos obtenidos con el
propósito de responder a las preguntar presentadas anteriormente. Primero, exploramos la
naturaleza del enlace Co-C mediante en estudio comparativo de AdoCbl y un cofactor análogo
conocido como MeCbl, ambos en sus formas libres. Segundo, obtuvimos un conjunto de
modelos del cofactor unido a GM para explorar las fuerzas involucradas en el proceso de ruptura catalítica del enlace Co-C, junto con la influencia del sustrato en esta. Tercero, con el fin de
comprender las fuerzas que manejan el ciclo catalítico, llevamos a cabo el estudio del estado
fundamental, intermediarios clave y estados de transición del ciclo catalítico usando modelos del
complejo GM-Ado-glm obtenidos a partir de cálculos de estructura electrónica. Los estudios de
la disociación del enlace Co-C en complejo con la enzima y del ciclo catalítico fueron enfocados
en el efecto del entorno enzimático cercano. La aproximación de cluster fue usando en todos los
cálculos que involucraron a GM como parte del modelo.
Nuestros principales resultados revelaron que el enlace Co-C es debilitado por el reemplazo
de base axial que sufre luego de unirse a la enzima por el par histidina-aspartato. Además existe
un efecto electrostático ejercido por el par lisina-glutamato de la enzima que estabiliza al radical
Ado•. La presencia de glm tiene un papel importante luego de la formación del radical Ado• ya
que permite la formación del radical un radical glm• que es más estable, propagando el ciclo
catalítico hacia la formación del producto. Finalmente, nuestros hallazgos revelaron que el
entorno enzimático conduce la reacción de isomerización mediante una estabilización diferencial
de los intermediarios y estados de transición asociados a la reacción. Además provee de un
importante soporte estructural. Los antecedentes entregados en este trabajo permitirán en el
futuro el diseño de bio-miméticos capaces de catalizar reacciones químicas extremadamente
complejas / Enzymes accelerate chemical reactions with exceptional selectivity making life itself
possible. Glutamate Mutase (GM) is an adenosylcobalamin (AdoCbl)-dependent enzyme that
catalyzes the reversible isomerization of glutamate (glm) to methylaspartate (masp). The AdoCbl
cofactor consists of an equatorial corrin ring, which has a Co+3 as the metal center axially
coordinated by a deoxyadenosyl moiety and intramolecularly by a 5,6-dimethylbenzimidazole
group. The accepted mechanism for the isomerization reaction begins with substrate binding to
the catalytic site, which induces the homolytic cleavage of the cobalt carbon bond (Co-C) of
AdoCbl, being this the first catalytic event. This generates an adenosyl radical (Ado•) that
subsequently abstracts a hydrogen atom from the substrate, forming a substrate-derived radical
and AdoH. The newly formed radical rearranges to a product-related radical, which eventually
re-abstracts the hydrogen from AdoH, leading into Ado• regeneration. Finally, the catalytic cycle
ends by Co-C bond formation. The generation of highly reactive radical intermediaries makes
this reaction very difficult to occur without side reactions. Thus, the need of proper catalytic
machinery able to control the reaction pathway is mandatory.
An intriguing question in bioinorganic chemistry is how upon substrate binding, the cofactorenzyme
complex modifies its electronic structure weakening the Co-C bond strength until its
homolytic dissociation. In addition, the exact reaction pathway that connects the Co-C bond
breaking with the hydrogen abstraction from the substrate remains uncertain. Finally, the exact
role of the enzymatic environment on the isomerization reaction mechanism is far from been
completely understood.
The need of deeper insights about the GM catalytic reaction, especially the control of the Co-
C bond dissociation process and the mechanism to manage the chemical transformation are
interesting challenges to be solved by computational chemistry approaches.
Here we present a large set of quantum chemical models obtained to answer the questions
above presented. First, we explored the nature of the Co-C bond by the comparative study of
AdoCbl and an analogous cofactor known as methylcobalamin (MeCbl), both in their free forms.
Second, a set of models of AdoCbl in complex with GM were obtained to explore the forces
involved in the catalytic Co-C bond dissociation process and the influence of the substrate on it.
Third, in order to shed light into the driving forces of the catalytic cycle, we performed the study
of models of ground state, key intermediates and transition states of the catalytic cycle using GM-Ado-glm complexes by means of modern electronic structure calculations. In all the
calculation involving the GM as part of the model, the cluster approach was used.
The studies of the Co-C bond dissociation in complex with the enzyme and the study of the
catalytic cycle were focused on the effect of the nearby enzymatic environment. Our main
results revealed that the Co-C bond is weakened in part by the axial ligand replacement
involving a histidine-aspartate pair, and the electrostatic effect exerted by the lysine-glutamate
pair from the enzyme which stabilizes the Ado• radical. After the formation of the Ado•, the
presence of glm leads to the formation of glm• radical, which is largely more stable than Ado•.
Thus, glm has an important role on the propagation of the catalytic cycle toward the product
formation. Finally, our findings revealed that the near enzymatic environment provides
differential stabilization of the reaction intermediaries and transition state mediated by the
properties of the interactions with the catalytic site. Additionally, it provides of an important
structural support. This understanding would allow in the future the design of bio-mimetic able
to catalyze highly complex reactions
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/105223 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Miranda Rojas, Sebastián Esteban |
| Contributors | Mendizábal Emaldía, Fernando, Zapata Torres, Gerald Amilcar, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Escuela de Graduados |
| Publisher | Universidad de Chile, CyberDocs |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Miranda Rojas, Sebastián Esteban |
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