VKORC1 est une enzyme membranaire du réticulum endoplasmique, responsable de la réduction de la vitamine K époxyde en vitamine K quinone, activant la synthèse des facteurs de coagulation. VKORC1 constitue ainsi une cible thérapeutique privilégiée des anticoagulants de type anti-vitamine K (AVKs). Cependant, certaines mutations de VKORC1 induisent une dérégulation physiologique et/ou une résistance aux AVKs. En l’absence de données structurales, plusieurs modèles topologiques de VKORC1 ont été proposés à partir des données biochimiques et biophysiques, fréquemment contradictoires. La topologie de VKORC1 ainsi que l'implication des résidus de cystéine (strictement conservés chez toutes les VKORs) dans le mécanisme enzymatique de la protéine restent incertaines. Nous avons construit, par des méthodes in silico, un modèle 3D de la VKORC1 humaine sauvage (hVKORC1WT) à l'échelle atomique. Des simulations de dynamique moléculaire de la protéine, en considérant tous les résidus de cystéine sous leur forme oxydée (SH), nous ont permis d'identifier les résidus de cystéine les plus susceptibles de former des ponts disulfures. Nous avons par conséquent décrit les conformations métastables de hVKORC1WT mimant les états fonctionnels de la protéine. L’étude de la reconnaissance des formes époxyde et réduites de la vitamine K par les conformations prédites de hVKORC1WT a mis en évidence leur sélectivité réciproque. Les conformations de hVKORC1WT ciblées par chaque forme de la vitamine K et leur rôle dans le mécanisme de réduction de la molécule ont ainsi été caractérisés. Nous avons postulé à partir de ces résultats le mécanisme enzymatique détaillé de hVKORC1WT et proposé la structure-cible des AVKs. Les interactions entre la cible prédite - hVKORC1WT à l'état actif - et trois AVKs différents ont été décrites en termes d’énergie libre de liaison. Ces résultats ont été corrélés avec les constantes d'inhibition mesurées in vivo, validant nos prédictions théoriques. Notre protocole, développé pour hVKORC1WT, est applicable aux formes mutées de l’enzyme. Il permettra la description des mécanismes modifiant l'activité réductase de hVKORC1 et/ou provoquant une résistance aux AVKs. Cette description ouvre la voie à la conception d'une nouvelle génération d'inhibiteurs surmontant les résistances aux AVKs. Notre concept et le protocole établi pour l’étude de hVKORC1 peuvent être étendus à l'analyse des VKORs mammaliennes et aux autres enzymes de la famille des oxydoréductases. / VKORC1 is an endoplasmic reticulum membrane-resident enzyme, responsible for vitamin K epoxide reduction to vitamin K quinone that activates coagulation factors synthesis. VKORC1 is thus a prominent target of vitamin K agonists (VKAs) in anticoagulant therapies. However, some VKORC1 mutations lead to physiological dysregulation and/or VKAs resistance. No VKORC1 structural data is available, and postulated topological models are based on biochemical and biophysical experimental observations frequently contradicting. Topology of VKORC1 and involvement of cysteines residues (highly conserved in VKORs) in the protein enzymatic mechanism remain unclear. We built an in silico 3D model of the wild-type human VKORC1 (hVKORC1WT) at the atomistic scale. Molecular dynamics simulations of the protein model, carrying all the cysteines residues in their oxidized form (SH), were used for identification of cysteines residues which may plausibly form disulfide bridges. We thus described hVKORC1WT metastable conformations depicting the functionally relevant states of protein. Study of the vitamin K (in epoxide and in reduced forms) recognition by the predicted conformations of hVKORC1WT revealed their reciprocal selectivity. The hVKORC1WT conformations targeted by each vitamin K form were established and their role in the reduction mechanism of this molecule was explained. Using our results, we postulated the comprehensive enzymatic mechanism of hVKORC1WT and we proposed the 3D structure as the VKAs target. Interactions between the predicted target - hVKORC1WT active state - and three different VKAs were characterized. The obtained affinities (free binding energy) were in good correlation with in vivo measured inhibition constants (Ki), thus validating our theoretical predictions. Our protocol developed for hVKORC1WT is suitable for a study of its mutants. Description of the enzymatic mechanisms of mutated hVKORC1 will lead to understanding of the modified reductase activity or/and to explaining of its resistance to VKAs. Such data are crucial for the development of novel strategies in the design of a new generation of inhibitors overcoming VKAs resistance. Our concept and the established in silico protocol can be extended to analysis of mammalian VKORs and other oxidoreductases family proteins.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2017SACLN008 |
| Date | 10 March 2017 |
| Creators | Chatron, Nolan |
| Contributors | Université Paris-Saclay (ComUE), Tchertanov, Luba, Lattard, Virginie |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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