A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma das culturas mais importantes para a economia brasileira, fonte de matéria-prima para produção de açúcar e álcool. O setor sucroalcoleiro tem expandido rapidamente devido à alta demanda por biocombustíveis. Para atender tal demanda e garantir a produção de açúcar, a área cultivada deverá ser expandida utilizando áreas de cerrado e pastagens degradadas no Sudeste e Centro-Oeste, caracterizadas por invernos secos com períodos de deficiência hídrica acentuada. Cultivares com tolerância a seca e alto potencial produtivo nessas regiões são desejadas para esta expansão, e a elucidação das bases moleculares e fisiológicas da tolerância é indispensável para o desenvolvimento de tais cultivares. Para investigar mecanismos fisiológicos e moleculares envolvidos na tolerância à seca metodologias baseadas em ensaios de campo e casa de vegetação foram avaliadas, com foco na fenotipagem e perfil de expressão gênica. O uso de polietilenoglicol (PEG) como agente estressor na solução de plantas hidropônicas foi avaliado para simulação da seca, bem como a avaliação do vazamento de eletrólitos após exposição ao Paraquat (methyl-viologen). Dois genótipos previamente selecionados com base no comportamento contrastante para resposta a seca foram utilizados para testar a hipótese dos mecanismos por trás da tolerância em cana, onde \'IACPSP 94-2094\' foi selecionado como tolerante e \'IACSP 97-7065\' como sensível à seca. Diferenças genotípicas no potencial hídrico foliar e trocas gasosas ficaram evidentes após 72h em plantas hidropônicas expostas ao tratamento contendo 15% PEG, e aliadas à melhor resposta oxidativa apresentada pelo tolerante após o tratamento de discos foliares com Paraquat sugeriram o potencial dessas metodologias para serem utilizadas como screening inicial de genótipos para tolerância a seca. Dez genótipos incluindo os dois contrastantes selecionados foram avaliados para resposta a seca em condições de campo na Usina Jalles Machado (Goianésia, GO), local com alta tendência de ocorrência de deficti hídrico. \'IACSP 94-2094\' mostrou características superiores de tolerância (fechamento estomático precoce, manutenção do potencial hídrico foliar e melhor ajuste fotoquímico), ausentes em \'IACSP 97-7065\'. Análises de microarranjos, RNAseq e RT-qPCR foram realizadas utilizando-se os genótipos contrastantes, buscando identificar genes responsivos a seca e importante para tolerância. De um total de 14.522 genes no chip de microarranjos , 91 (~0.63%) foram diferencialmente expressos entre os ensaios irrigado e sequeiro, enquanto que 576 (~4%) apresentaram expressão diferencial durante deficit severo, incluindo muitos genes tradicionalmente associados com a resposta à seca. Amostras dos mesmos genótipos cultivados em casa de vegetação com ou sem irrigação foram utilizadas para análises de RNAseq. De um banco de dados contendo 43.141 genes, 2.300 (5.3%) foram diferencialmente expressos, incluindo genes novos e não caracterizados que possam ter papel importante na resposta à seca e estabelecimento da tolerância. A maioria dos genes identificados pelos microarranjos também foram detectados por RNAseq, havendo alta correlação entre as abordagens (0.78 e 0.84 para os genótipos tolerante e sensível, respectivamente). Após validações por RT-qPCR, genes relacionados à resposta a seca estão sendo utilizados para estudos de genômica funcional, objetivando desenvolver novas cultivares tolerantes a seca, seja através do melhoramento convencional ou das técnicas moleculares. / Sugarcane (Saccharum spp.) is a major crop in Brazil as feedstock for the sugar and ethanol industries. The Brazilian sugarcane industry has been expanding rapidly due to increased demand for biofuels. To attend the increasing ethanol demand and secure food production, sugarcane production must expand the cultivated area, incorporating land from \'cerrado\' and degraded pastures in Southeast and Western Brazil, areas characterized by a dry winter with a prolonged water deficit period. Drought-tolerant cultivars with higher yield potentials in such regions are desired for this expansion, and the elucidation of the molecular and physiological basis of drought tolerance in sugarcane is valuable for developing such cultivars. To investigate physiological and molecular mechanisms involved in tolerance to water deficit, different approaches based on field and greenhouse trials were evaluated, mainly focusing on phenotyping and gene expression profiling. The addition of polyethylene glycol (PEG) as a stress inducer in nutrient solution was also evaluated to simulate droughtresponse in hydroponically-grown sugarcane, as well as the solution\'s electrolyte leakage after exposure of leaf segments to methyl-viologen (Paraquat). Two genotypes previously selected were used to test the hypothesis of the mechanisms underlying on the differential response to drought, due to their behavior as contrasting genotypes, where \'IACPSP 94-2094\' was tested as drought-tolerant and \'IACSP 97-7065\' as drought-sensitive. When plants were hydroponically grown on solution containing 15% PEG, genotypic differences for leaf water potential and gas exchange were apparent after 72 h, whereas the improved oxidative response of the tolerant genotype after leaf-disk treatment with methyl-viologen suggested the potential of this approach to be used for early drought-tolerance screening. Ten genotypes including the two previously selected were evaluated for drought tolerance on field conditions at \'Jalles Machado\' sugarmill (Goianésia, GO), a drought-prone location. \'IACSP 94-2094\' showed enhanced features for drought tolerance (early stomatal closure; maintenance of leaf water potential and photochemical adjustment), absent in \'IACSP 97-7065\'. Molecular studies (microarrays, RNAseq and RT-qPCR) were also conducted using these genotypes, aiming to identify drought-resposive genes and confirm their roles on tolerance. From a set of 14,522 genes in a microarray chip, 91 (~0.63%) were differentially expressed between irrigated and non-irrigated treatment during early drought, whereas 576 (~4%) showed differential expression during severe drought between water treatments, including many genes traditionally associated with drought response. Samples from these same genotypes grown in greenhouse conditions under irrigation and water deprivation were used for gene expression profiling by RNAseq. From a sugarcane reference dataset with 43,141 genes, 2,300 (5.3%) genes were identified as differentially expressed, including novel and undescribed genes that might play a role in drought tolerance. Most genes identified as differentially expressed on microarrays were also observed for RNAseq, with high correlation between both approaches (0.78 and 0.84 for tolerant and sensitive genotypes, respectively). After validation, genes related to drought response have been used for functional genomics studies aiming the development of new cultivars tolerant to drought, either through conventional or molecular breeding.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-02042013-112102 |
| Date | 01 February 2013 |
| Creators | Oliveira, João Felipe Nebó Carlos de |
| Contributors | Figueira, Antonio Vargas de Oliveira |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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