A habilidade de sensoriar o ambiente extracelular e responder às suas mudanças é inerente para a maioria das bactérias. As concentrações de nutrientes direcionam os processos metabólicos relacionados à sobrevivência e proliferação. O fosfato inorgânico (Pi) é um dos nutrientes cuja regulação, sensoriamento e sinalização são bastante conservados em bactéria. Um dos mecanismos de captação do íon fosfato com alta afinidade é o sistema Pst, um transportador do tipo ABC (ATP-Binding Cassette) , localizado na membrana interna das células. Este transportador, juntamente com as proteínas PhoR/PhoB que formam um sistema de dois componentes (Two-Component Regulatory System) , são capazes de sensoriar e monitorar os níveis deste íon nas células. Ambos os sistemas pertencem ao chamado regulon Pho, conjunto de genes envolvidos no transporte, captação e metabolização do fosfato. Estudos tem mostrado que a interação entre os sistema Pst e o sistema doiscomponentes PhoR/PhoB é mediada pela proteína PhoU, um regulador negativo cujo gene encontra-se no mesmo operon do transportador. Apesar de muito estudados em Escherichia coli , poucas informações existem sobre as características destes sistemas em Xanthomonas citri subsp. citri , bactéria responsável pelo cancro cítrico e de grande importância econômica para o país. Estudos realizados pelo nosso grupo mostraram que X. citri conserva a maioria dos genes descritos como pertencentes ao regulon Pho, incluindo o sistema Pst, as proteínas PhoR/PhoB e PhoU. Este trabalho, portanto, tem como objetivos, a caracterização funcional e estrutural da proteína PhoU de X. citri e a análise da possível interação de PhoU com a proteína PhoR, a histidina quinase do sistema dois componentes. Para tal, as proteínas foram expressas em linhagens de E. coli Tuner e purificadas por cromatografia de afinidade a metal, seguida de exclusão molecular. Visando a caracterização biofísica e estrutural da proteína PhoU, foram realizados ensaios de dicroísmo circular, cristalização, análises de bioinformática e modelagem molecular. Os resultados de bioinformática mostraram que PhoU conserva características estruturais e funcionais quando comparada com ortólogos. Após sua purificação, a proteína foi produzida na sua forma enovelada e mostrou interação com ligantes, conforme descrito na literatura para ortólogos. A expressão da proteína PhoR também foi obtida e ensaios de pull-down foram realizados para a caracterização da interação entre PhoU-PhoR. Adicionalmente, foram realizados estudos de expressão das proteínas em diferentes condições de cultivo, utilizando-se anticorpos policlonais anti-PhoU e anti-PhoR. Os resultados apresentados neste projeto são de grande importância uma vez que se obteve a padronização dos processos de produção de ambas as proteínas e ensaios biofísicos e estruturais para a futura caracterização do complexo, o que será de grande relevância para a compreensão do papel destes sistemas na fisiologia da bactéria. / The ability to sensor the extracellular environment and respond to its changes is inherent to most bacteria. Nutrient concentrations direct metabolic processes related to survival and proliferation. Inorganic phosphate (Pi) is one of the nutrients whose regulation, sensing and signalling are quite preserved in bacteria. One of the mechanisms for phosphate ion uptake with high affinity is the Pst system, composed by an ABC transporter (ATP-Binding Cassette), located on the inner membrane of the cells. This transporter, along with the PhoR/PhoB proteins, which form a Two Component Regulatory System, are capable of sensing and monitoring the levels of phosphate in cells. Both systems belong to the called regulon Pho, set of genes involved in phosphate transport, uptake and metabolism. Studies have shown that the interaction between the Pst system and the two component PhoR/PhoB system is mediated by the PhoU protein, a negative regulator, whose gene is located in the same operon of Pst system. Although much studied in Escherichia coli , there are few information about of these systems in Xanthomonas citri subsp. citri , the major causative of citric canker. Studies conducted by our group showed that X. citri conserves most of the genes described as belonging to regulon Pho, including the Pst system, the proteins PhoR/PhoB and PhoU. This work, therefore, aimed at performing functional and structural characterization of the X. citri PhoU protein and analyzing the possible interaction of PhoU with the PhoR protein, the histidine kinase of the Two Component System. For this, the proteins were expressed in E. coli Tuner strains and purified by metal affinity chromatography, followed by size exclusion chromatography. Aiming at the biophysical and structural characterization of the PhoU protein, we performed circular dichroism, crystallization, bioinformatics and molecular modeling. The results of bioinformatics showed that PhoU retains structural and functional characteristics when compared with orthologs. After purification, the protein was produced in its folded form and showed interaction with ligands, as described in the literature for orthologs. Expression of the PhoR protein was also obtained and Pull Down assays were performed for the characterization of the interaction between PhoUPhoR. In addition, protein expression studies were carried out under different culture conditions using polyclonal anti-PhoU and anti-PhoR antibodies. The results presented in this project are of great importance, once the standardization of the production processes of both proteins has been obtained, as well as biophysical and structural information. These information will be important for future characterization of the complex, which will be of great relevance for the understanding of the role of these systems in the physiology of bacteria.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-26032018-150211 |
| Date | 31 January 2018 |
| Creators | Pena, Pâmela de Oliveira |
| Contributors | Fernandes, Andrea Balan |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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