A bactéria XvIella fastidiosa tem sido associada com doenças economicamente importantes como a clorose variegada de citros (CVC) em citros no Brasil e a doença de Pierce em videiras nos Estados Unidos (Hopkins, 1989 e Purcell et al., 1997). A importância econômica da indústria de citricultura no Brasil e o grande prejuízo causado pela CVC em pomares brasileiros têm resultado em um extensivo programa de pesquisa que começou com o sequenciamento do genoma completo da X Fastidiosa (Simpson., et ai 2000). A bactéria é transmitida por insetos conhecidos como \"cigarrinhas\" que se alimentam da seiva do xilema. O principal efeito da doença é o surgimento de manchas amarelas nas folhas que progridem para toda a extensão levando-a à necrose. Os frutos de plantas infectadas são pequenos (representando 1/3 do tamanho de um fruto normal), apresentam casca dura e são impróprios para o consumo. Esta bactéria apresenta em seu genoma um Operon contendo 9 genes (B,C,D,E,F,H,J,K,M) responsáveis pela biossíntese do exopolissacarídeo denominado goma fastidiana, que pode estar envolvido na sua patogenicidade. No presente trabalho temos como objetivo estudar as enzimas GUMC, que provavelmente está envolvida na etapa de polimerização e/ou secreção do polissacarídeo formado através da membrana da bactéria, e GUMK, uma glucuronosiltransferase ou glicosiltransferase IV, que adiciona uma molécula de ácido glicurônico à molécula da manose para a formação do tetrassacarídeo (manose-α-1,3- glucose-β-1,4-glucose-P-P-polyprenol). O gene gumC foi clonado no vetor de expressão pMALc-2x, a proteína de fusão GUMC-MBP foi expressa com uma massa molecular calculada de 98kDa e foi purificada através de coluna de afinidade. A proteína de fusão foi caracterizada pela reação com o anticorpo anti-MBP por imunoblotting. Através da técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (EDL), foram realizados estudos de agregação com a proteína de fusão GUMC-MBP. Ensaios de cristalização foram realizados e microcristais da proteína de fusão GUMC-MBP foram obtidos. Após a clivagem da proteína de fusão com a enzima Factor Xa, a enzima GUMC foi separada através da cromatografia de troca aniônica. A massa molecular da enzima foi determinada através da cromatografia de filtração em gel, superose 12, eluindo na forma monomérica com 53kDa. A proteína GUMC foi caracterizada pela reação com o anticorpo anti-GUMC-MBP (produzido em camundongos) através da técnica de imonublotting. A enzima também foi caracterizada através da técnica do dicroísmo circular (CD), apresentando um espectro característico de estrutura secundária enovelada, composta predominantemente por α-hélices. Foram realizadas 9 construções para a retirada das regiões transmembrânicas das regiões 5 e 3° do gene gumC (1 construção para o vetor de expressão pET29b e 8 para o vetor pMALc-2x). Em uma das construções, a proteína de fusão modificada GUMC-MBP 5C foi expressa no vetor de expressão pMALc-2x e foi purificada em coluna de afinidade. A proteína de fusão modificada GUMCMBP foi clivada com a enzima Factor Xa. Estudos de agregação molecular das proteínas de fusão GUMC-MBP e GUMC-MBP modificada C5 e das enzimas GUMC e GUMCC5 modificada poderão ser realizados futuramente. O gene gumK foi clonado no vetor pMAc-2x, a proteína de fusão GUMK-MBP foi expressa, com uma massa molecular calculada de 86kDa e foi purificada em coluna de afinidade. A proteína de fusão foi caracterizada por imunoblotting e medidas de dicroísmo circular foram realizadas. Após clivagem com o Factor Xa, a enzima GUMK foi purificada através da cromatografia de troca catiônica. Ensaios de cristalização foram realizados onde microcristais e cristais em forma de agulha foram obtidos. Futuramente, estudos estruturais e funcionais destas enzimas poderão trazer informações sobre a patogenicidade da X fastidiosa, assim como possibilitar o desenvolvimento de inibidores específicos / The bacterium Xylella fastidiosa has been associated with diseases of economically importante crop as the citrus variegated chiorosis (CVC) in citrus in Brazil and the Pierce\'s disease in grapevines in the United States (Hopkins. 1989 and Purcell et al., 1997). The economic importance of the citrus industn - in Brazil and the high level of damage caused bv CVC in brazilian orchards hm -e resulted in an extensive research program starting with the sequencing of the entire genome of X. fastidiosa (Simpson et al.. 2000). The bacterium is transmitted bv specific sharpshooter lealloppers when the insect feeds on the talem sap. Tvpical disease svmptoms include conspicuous variegations. with chlorotic amas on the upper side and small necrotic lessions on the lower side of the leaves. The affected fruits are smaller. often no more than one-third of the diameter of healthy fruits, hardened and without commercial value. X fastidiosa has a nine-gene operou (B, C. D. E. F, H. J. K. and M genes) responsible for the biosvnthesis of exopolysaccharides, denoted fastidian gum, that mas be linked directly to the pathogenecin - of the microorganism. In this work our main aim is to study the GLIM(\' enzyme, that may be responsible for gum polymerization or secretion through the membrane of X fástidiosa and GUMK enzyme, a glucuronosvltransferase or glycosyltransferase IV. that adds a glucuronic acid to tetrasaccharide manose-α-1,3- glucose-β-1,4-glucose-P-P-po1visoprenyl. The gume gene was cloned into the pMAL-c2x expression vector, and GIIMC-MBP fusion protein was expressed with estimate molecular mass 98kDa. was purified through affinin - column and was characterized through the reaction of antiMBP antibodv by imunoblotting. Molecular aggregation studies of GII.MC-MBP fusion protein were measured by Dynamic Light-Scattering (DLS). Crystallization screens were made and microcrvstals were obtained. The GUMC-MBP fusion protein were cleavaged with Factor Xa and the GIM\' enzyme purified through ion exchange chromatography. The GUMC molecular mass were determined using size exclusion chromatography, superosel2. Anti-GUMC-MBP antibodies were already produced in mice and were used to characterize the GUMC protein. by imunoblotting technique. In addition, according to circular dichroism spectroscopy, GUMC protein prevalent secondary structure is α-hefix. Nine constructions for the gtmiC gene. without 5 - and 3° transmembrane regions (one for cloning in pET29b and 8 for cloning in pMALc-2x) were carried out. One of the constructions. the modified fusion protein GIIMC-MBP C5. was expressed into the pMALc-2x expression. vector. The modified fusion protein GLIMC-MBP 5C were purified through affmin - resin and cleavaged with the Factor Xa enzvme. In the future. aggregation states of GIIMC-MBP and modifiecl GUMC -MBP C5 fusion proteins. and GII.MC and modificai GUMC C5 enzymes could be measured by DLS and compared. The gumK gene. cloned into the pMALc-2x expression. vector. expressed a GIIMK-MBP fusion protein soluble with molecular mass 86kDa. This fusion protein was purified through affmin - resin. The GIIMK-MBP fusion protein was characterized for imunoblotting and CD measurements. The GUMK-MBP fusion protein was cleavaged with Factor Xa enzvme and the GUMK enzyme was purified through cationic Exchange chromatography. Crvstallization screens were made and micmcrystals and crystals in needle form were obtained. Future enzvmes characterization three-dimensional structure will allow - further structural and functional studies on the pathogenicity of X. fastidiosa. as well as to development of specific inhibitors
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06122013-113617 |
| Date | 17 April 2006 |
| Creators | Pieri, Celina de |
| Contributors | Oliva, Glaucius |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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